作者： sinovale

实验原理

    Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

  实验步骤

• 直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
• 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
• 可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

• 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
• 4 ℃ 10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）
• 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃ 放置20-30min。

植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导至电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。

• 4 ℃ 10 000rpm离心10min，去上清。

离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

• 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
• 4 ℃ 10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
• 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

实验注意事项

预防RNase污染，应注意以下几个方面

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。