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Cytek DxP Athena 流式应用

调节性T淋巴细胞流式检测

【实验介绍】调节性T细胞（Treg）是一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%-5%，约占外周血CD4+T细胞的5%-10%。Treg参与免疫应答/免疫耐受调控。CD25表达于大部分的Treg细胞上，CD127是IL-7受体一部分，在Treg上低表达。
【实验方法】取100μL抗凝全血，置于流式管中，向管中加入适量荧光标记的抗体，室温避光孵育20min，再加入2mL 1x溶血素，室温避光孵育10min，1500rpm 离心5min，小心弃去上清，加3mL染色洗液（AMCS）重悬，再1500rpm离心 5min，弃去上清，再加入1mLAMCS重悬进行上机检测。
【主要试剂】CD3-BV605，CD4-FITC，CD8-APC H7，CD25-PE，CD127-APC
【实验结果】

细胞周期流式检测

【实验介绍】使用一些核酸染料和DNA进行结合可对DNA进行定量分析，G0期细胞为不参与增殖周期循环的细胞，即为静止细胞，其细胞为恒定的二倍体DNA含量（2C），G1期细胞参与细胞周期循环，其与G0期细胞DNA含量相同（2C），当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，直至DNA倍增为四倍体细胞，即G2期（4C），最终进入M期，M期为分裂到2个子细胞之前。
【实验原理】正常生物细胞，DNA含量随着细胞增值，周期时相发生变化，即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）、G2/M期（4C）。核酸染料碘化丙啶（PI）能与DNA进行特异性结合，其荧光强度与DNA含量成正比，可以通过流式直方图来进行区分。【主要试剂】PI/RNase染色液
【实验方法】1. 消化：0.25%胰酶（无EDTA）消化，将细胞消化成单细胞；2. 洗涤：2000rpm离心5min，收集细胞，弃上清，加入3mL预冷（4℃）的PBS进行重悬、离心洗涤3次；3. 固定：加入3mL预冷的70%乙醇到细胞沉淀中，于4℃固定过夜；4. 染色：离心收集细胞，加入3mL PBS洗涤两次，加入500μL PBS（含50μg/mL PI，100μg/mL RNase, 0.2%Triton X -100），4℃避光孵育30min；5. 检测：分析前4℃避光保存样本，1h内上样。

【实验结果】

采用FlowJo软件自带的Cell Cycle工具进行分析，其中G1 mean：61979.77，G2 mean：124155.05，G2:G1=2.003。

细胞凋亡流式检测

【实验介绍】细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身程序结束其生命的过程，细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，存在多种抑制或促进凋亡的调控途径，因而可人为的诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。
【实验原理】凋亡细胞形态学发生改变，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，构成早期凋亡的重要生化特征，PS能被特异性的Annexin V-FITC探针所标记，而PI能标记凋亡中期和晚期的细胞，故两者结合可有效区分活细胞、凋亡早期、凋亡晚期和坏死细胞。
【主要试剂】Annexin V-FITC，PI
【实验方法】1. 收集细胞：培养的细胞（酶消化处理）或PBMC， 2000rpm离心5min，PBS洗涤1-2次，制备成单细胞悬液；2. 细胞染色：取细胞约105/管，洗涤后加入染色缓冲液100μL，再加入适量的Annexin-V-AF488和PI 染色液。避光孵育15min，加入染色缓冲液400μL。
【实验结果】Q2-1：活细胞、Q2-4：早期凋亡、Q2-2：晚期凋亡、Q2-1：坏死。

细胞因子流式检测

【实验介绍】细胞因子（CK）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种CK，一种CK也可由多种细胞产生。细胞因子主要分类为：白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、生长因子（G）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、趋化因子等。血液中未活化的白细胞内细胞因子表达极低，当被刺激活化后，胞内细胞因子大量合成并分泌到细胞外发挥作用。
【实验原理】实验采用刺激剂（如佛波酯）来刺激细胞因子分泌，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，再通过细胞固定和打孔等处理后，采用细胞因子特异性的单克隆抗体进行细胞内荧光染色。
【主要试剂】CD3-APC，TNF-α-FITC，INF-γ-PE
【实验方法】1. 对照管和检测管中均加入100μL肝素抗凝全血和100μLPRM1-1640溶液；2. 对照管加入3.4μL 1mg/mL的莫能星工作液，检测管加入5μL 1μg/mL的PMA工作液，4 μI 50 μg/ml Ionomycin 工作液和3.4 μl 1 mg/ml 莫能星工作液。3. 37 ℃，5% CO2 培养箱培养 4~6 h。4. 混匀，取出 100 μI，加入适量 CD3-APC，按照试剂盒说明进行孵育；5. 用破膜剂固定和破膜；

6. 加入适量TNF-α-FITC，INF-γ-PE，按照试剂盒说明进行孵育；

7. PBS洗涤，去上清，PBS重悬后上机检测。

【实验结果】

双阳性区域（Q2、Q6）为CD3+T细胞细胞因子分布。

γδT细胞流式检测

【实验介绍】T淋巴细胞亚群根据TCR不同可分为TCR αβT细胞和TCRγδT细胞，γδT细胞可直接识别并结合Ag分子，无需与MHC分子结合，无需APC提呈，血液和淋巴组织中γδT细胞约占总T细胞的1-5%，其执行固有免疫防御（吞噬功能），类APC作用，并分泌IL-2、IFN-γ、IL-17等细胞因子等，与同等数量的αβT细胞相比，其分泌细胞因子的能力更强。
【实验原理】活化的γδT细胞能大量表达IL-2,，结核分枝杆菌低分子多肽抗原（Mtb）能活化PBMC，增值培养后能获得较高比例的γδT细胞，用佛波酯酸（PMA）和离子霉素（IM）活化γδT细胞，检测γδT细胞内的IL-2表达情况，从而表明γδT细胞的百分比。
【主要试剂】CD3-APC、CD8-PE、IL-2-APC-Vio770
【实验方法】1. 细胞制备：分离PBMC细胞，采用RPMI培养基进行活化培养，得到Mtb活化的T细胞（MtbAT）；2. 细胞处理：1mL  PBMC（MtbAT）中依次加入PMA（20ng/ml），IM（1μg/ml），BFA（10μg/ml），37℃、5%CO2条件下培养5h后收集细胞，PBS洗涤并重悬细胞；3. 混匀，取出 100 μI，加入适量 CD3-APC，CD8-PE，按照试剂盒说明进行孵育；4. 固定破膜：用破膜剂固定和破膜；5. 加入适量IL-2-APC-Vio770，混合4 ℃避光孵育30min；

6. 洗涤：PBS洗涤2次并重悬，流式上机检测。

【实验结果】

下图Q1单阴性为TCRγδT细胞。

NK细胞流式检测

【实验介绍】自然杀伤细胞（NK）是一类不依赖抗体且无MHC限制的一类细胞，其识别靶细胞为非特异性，可释放穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等杀伤介质，介导杀伤靶细胞，NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。
【实验原理】NK细胞细胞是一类表达80-90%的CD16和大于95%的CD56具有调节功能的免疫细胞，常联合CD16和CD56作为NK细胞的特异性标志，本实验以外周血作为对象，运用荧光标记的抗体与待侧细胞表面的标志结合，运用流式细胞仪检测特异性荧光信号，最终获得CD3-CD16/56+的NK细胞数量和比例等数据。
【主要染料】CD3-FITC、CD16+56-PE
【主要结果】CD3-CD16+56+为NK细胞群体

间充质干细胞（MSC）流式检测

【实验介绍】间充质干细胞（MSCs）是继胚胎干细胞和造血干细胞之后具有多向分化的实用型干细胞，其具有如下特征：1）强大的增值能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种细胞的能力。2）免疫调节功能：通过细胞间的相互作用及产生细胞因子干扰树突状细胞功能并抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。3）来源多样、取材方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。
【实验原理】hMSCs能表达CD73、CD90、CD105抗原，基本不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR，实验采用荧光素标记的抗细胞表面抗原单克隆抗体（mAb）对细胞进行表染，并采用mIgG1和mIgG2b作为同型对照，流式细胞术检测其荧光强度的变化。
【主要试剂】CD105-PerCp-Cy5.5、CD73-APC、CD90-FITC、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA_DR-PE、mIgG1-PerCP-Cy5.5/APC/FITC、mIgG2b-PE。
【实验方法 】1. 消化：贴壁细胞使用0.25%胰酶消化，离心弃上清，加入适量染色缓冲液，使细胞浓度约5×106/mL；2. 对照：设定阴性管、同型对照管、单染管和多色样本管；3. 染色：分别加入适量的抗体，再分别加入100μL细胞悬液，室温避光孵育30min；4. 洗涤：加入300-500μL FBS洗涤2次并重悬；5. 检测：混匀后上机检测。

【实验结果】

Tube5为空白对照管、Tube1/3为单染管、Tube6/8为同型对照管、Tube7/9为多色样本管。显示，样本几乎不存在非特异性吸附，CD90和CD105阳性较强，其他未列出指标也都符合hMSC检测指标。

多色流式分析技术比较

随着激光器配置的增加和新型染料的上市，流式分析已经从早期的单激光2色，2激光6色发展到现在3激光13色甚至更高。

通过标记更多的荧光染料，我们可以检测细胞表面标志物或胞内分泌标志物探索细胞功能，并鉴定稀有细胞类型。然而，由于传统流式技术的限制，多色流式实验的开展还存在诸多困难：

1. 需要配置多激光（5激光）才能检测15色以上，成本高

2. 染料之间的补偿干扰大，实验设计要求高

3. 现有的染料可以满足多色实验搭配需求

4. 无法保证所有检测通道的高灵敏度

面对这一现状，来自Cytek公司最新研发的AuroraTM光谱流式细胞仪，通过其革命性的设计，使科学家不再受限于传统流式细胞技术，可以轻松开展多色流式实验。这一切是因为AuroraTM使用专利光波分复用技术，可以检测荧光染料从400nm到900nm的全部发射谱征；使用专利解析技术，即使发射光谱重合度很高的两个荧光染料，也可以轻松区别。同时借助全新设计的专利光路系统和电子信号处理系统，可以保证高灵敏度和分辨率。其主要特点如下：

与传统流式区别在于，不再是仅仅检测某一段区域的光谱发射波峰，而是检测并收集荧光被所有激光激发后在400-900nm内的全部发射谱征信息。这样就能够收集更多的信息（如同指纹一样），可以轻松区别在传统细胞仪上由于发射波峰高度重叠而无法同时使用的染料。（见下图）

传统流式细胞仪的发射波峰检测方式（波峰重叠）

AuroraTM 光谱流式细胞仪检测染料的独特发射谱征（清晰区分）

（横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度）

AuroraTM的这一创新技术带来的最大优势就是，我们在做多色实验选择荧光染料时更加灵活。原来在传统流式细胞仪上无法同时搭配使用的染料，现在都可以同时使用。

 

可以任意选择荧光染料，不受光谱重叠限制

下表为目前在AuroraTM 3激光系统上可以使用的染料列表

从上述的列表中选取20种染料搭配相关抗体，从下表可以看到，在传统流式细胞仪上，这些染料高度重叠，无法进行实验。

AuroraTM 20色组合实验数据

（详细信息请参考彩页）

 

三种不同技术比较表

Cytek Aurora™ Merck ImageStream CyTOF
产品概况 Aurora使用全新的技术，可以检测荧光染料从400-900nm的全发射光谱，使用专利解析技术，即使发射光谱重合度很高的两个荧光染料也可以轻松区别。同时借助全新设计的专利光路系统和电子信号处理系统，可以保证高灵敏度和分辨率。 在传统流式荧光信号强度参数基础上，提供量化成像参数用于不同细胞群体的分析。 CyTOF质谱流式细胞仪率先使用金属元素做为流式抗体、染料的标志物，利用质谱对标记细胞进行定量检测。
突出特点 Aurora采用光谱专利解析技术，无需调节光谱之间的补偿，既继承了传统流式的特点又打破常规，实现3激光51通道的革命性跨越。 ImageStream仪器设计重点偏向细胞成像，把流式的液流聚焦分离成单细胞技术和细胞荧光显微成像技术结合起来，通过细胞形态学观察，进行圈门。 CyTOF通过与质谱技术相结合，采用金属元素标记物，再用流式细胞原理分离成单个细胞，获得单个细胞的原子质量谱，再进行数据转换实现细胞检测
细胞分析 Aurora可沿用传统流式细胞分群圈门经验，各细胞群体分布情况比较固定，再结合其超高的灵敏度，即使是弱阳性信号也能进行精确区分。 ImageStream可结合细胞形态综合参考进行圈门，但与传统流式圈门结果相差不大，可作为一个辅助和验证性工具。 CyTOF采用金属元素标记，细胞亚群等群体分布与常规流式变化较大，不易确定目标细胞群。
操作便捷 Aurora专用的SpectroFlo软件让你可以方便快捷的进行QC、实验设定、数据分析等，并带有荧光染料库，让你操作轻松上手 ImageStream操作界面中，偏向于细胞形态展示，流式图像和数据的多样和灵活性欠缺，且数据量大，速度慢 CyTOF把流式与质谱技术结合起来，复杂的数据转换，仪器成本较高，使用困难
检测通道 Aurora单激光可以配置16个检测通道，5激光系统可以达到80个荧光检测通道 ImageStream最多12个通道，＞12色的实验就无法进行 CyTOF虽检测通道数达到120个，但目前用来标记抗体的金属标签仅有30余种。
荧光染料选择 可以任意选择荧光染料搭配，灵活程度高，多色实验成本低 受传统流式技术限制，染料选择困难，根本无法满足多色流式需求。 只能使用特殊的金属标记抗体，成本昂贵，选择有限
性价比分析 Aurora诠释了流式革命性进展，实验分析更精细，这是传统流式无法实现的，超高的性能和公平公正的价格实现超高性价比。 ImageStream最高12个检测通道。辅助细胞成像技术，性能方面表现出后劲不足，价格比普通流式和荧光显微镜总价高出很多，性价比平平。 仪器硬件昂贵，后期使用耗材和试剂成本高，性价比低。
灵敏度 采用新的半导体检测器，光电转换效率是传统流式的10倍，而噪音则只有十分之一，具有超过灵敏度。 使用CCD作为检测器，灵敏度极差。 将细胞破碎之后进行分析，已经不是从完整的细胞功能角度研究，更类似于质谱检测方法，无法比较灵敏度。

Cytek DxP AthenaTM流式细胞分析仪

DxP AthenaTM流式细胞仪系统使用DxP 技术，能够解决多色染色方案中弱表达群体难以检测的问题。多至3激光13荧光通道的配置供用户灵活选择，每种配置均能提供高灵敏度的分析功能。配备QbSureTM专利质控系统，确保实验结果的重复一致性。

  • 配置灵活，轻松升级

可从2激光6色升级到3激光13色

  • 专利QbsureTM质控系统

提供每一个通道分辨率（Resolution）检测数值

  • 高分辨率以区分弱信号群体

高性能PMT和高效光路系统

  • 体积小巧，操作简单

FlowJo CE获取软件

DxP AthenaTM 10色结果

Violet/Blue/Red 13-color

Blue/Red/Violet 10-color

Blue/Red/Violet 8-color

Blue/Red 6-color

DxP AthenaTM 配置

Blue/Red/Violet 13-color

Cytek公司流式细胞仪Athena技术分析

DXP AthenaTM流式细胞仪概述

DXP AthenaTM流式细胞仪是由Cytek公司全新设计和研发，提供从2激光6色到3激光13色的灵活配置，被广泛应用于各大医院和科研单位，研究领域包括免疫学细胞检测和监控，干细胞研究和治疗、药物毒理研究等等。DXP AthenaTM因其卓越的性能和先进的设计，在该领域大放异彩。

它的优势在于：

1 . 高分辨率：结合Cytek公司最先进的DXP技术和高性能的PMT（光电倍增管），确保了仪器的高灵敏度和分辨率，能够从阴性细胞群里轻易区分弱阳性信号。从而解决传统流式中弱信号难以被识别而被认为是阴性群的情况。

2. 清洗方便：仪器面板具有一键清洗功能，做完实验进行一键清洗，仅仅需要4分钟，而且仪器具有每月自动清洗程序，可最大限度减少停机时间和简化维护流程。

3. 结果稳定：仪器配置有QbSureTM专利质控技术，可全方面监测仪器的光路噪音大小，光电转换效率，并验证激光和液路聚焦情况，综合多种参数判定仪器的分辨率。质控微球采用6峰微球，可检测所以的荧光通道，比单峰微球检测更全面。

4. 升级灵活：仪器采用可插拔式滤光片，多色组合更灵活，可由2激光6色升级到3激光13色，同时可以配置96孔板自动进样器（AMS）。实现高效便捷的样本检测。

5. 数据收集和分析沿用FLowJo软件，FlowJo软件功能强大，应用普遍，界面熟悉，操作便捷。

Athena应用示例如下：

  • 生物化学：

通过特异性标记研究分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。如细胞周期蛋白表达判断细胞周期、Annexin V研究细胞凋亡。这对于传统生物化学研究是极大的补充和拓展。

示例：流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白

检测血小板膜糖蛋白（GP）可用于诊断血小板功能缺陷性疾病，如血小板物理症，巨大血小板综合症等。可采用IgG-FITC特异性标记GP蛋白进行研究。左图为正常人GP蛋白表达，右图为患者GP蛋白表达，可见患者的GP蛋白表达功能低于常人。

  • 免疫学：

免疫系统中不同类型的细胞的区别不仅是细胞表面标志物的差别，还有对于不同病原体或是刺激的反应。将流式细胞术的大样本量和直观化图像结合起来、可以有效研究T细胞和抗原递呈细胞的相互作用和免疫突触上的蛋白质聚集、化学因子诱导的形变和吞噬等。

示例：单克隆抗体阻断HLA-B27转基因大鼠T细胞活化

噬菌体文库中的单克隆HD5抗体能靶向细胞表面B272同型二聚体，进一步抑制HLA-B27转基因大鼠早期TNF产生和CD4+T细胞的扩增 。下图设定对照组（W6/32），显示了HD5阻断B272与白细胞的相互作用，并通过B272阻断CD4+T细胞的活化。

  • 肿瘤学：

通过研究淋巴细胞比例和细胞周期、凋亡和增殖等可诊断肿瘤患者的病情，Athena通过精确的数据收集和分析，多通道的多色实验，研究环境中的健康风险和药物剂量评估，可以大大推动这个研究领域。

示例：流式细胞仪检测网织红细胞观察化疗后骨髓功能变化的研究

利用流式细胞仪计数末梢血网织红细胞（Ret），并进行其RNA含量的分析，对急性白血病和恶性淋巴瘤患者化疗后动态观察骨髓红系造血活力的变化。

  • 干细胞：

在体内，干细胞具有分化成各种细胞的能力。阐明这个过程可以促使我们更好的理解动物发育的过程和制定出更好的替代受损组织的治疗方案。由于干细胞在向终末分化细胞分化过程中通常会涉及到明显的细胞形变，所以量化成像流式分析系统十分适于这方面的研究。测量维持干细胞多潜能性蛋白的细胞定位或是衡量干细胞分化过程中的信号转导事件，量化成像流式分析系统可以分析大样本量细胞的特点简化了稀有干细胞的鉴定和分类。

示例：流式细胞仪观察脉冲电磁场干预骨髓间充质干细胞的生长

采用临床上常用于治疗骨折的音频脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行照射刺激，流式检测细胞的增殖、凋亡水平和细胞周期的变化。左图为u第三代大鼠间充质干细胞培养第6天细胞周期检测结果，右图为不同时间段音频脉冲电磁场刺激后大鼠BMSCs的细胞周期变化。表明，第3，6，9天磁场干预组S期细胞百分比比对照组高，与流式细胞活率检测结果相吻合。

  • 病毒学：

病毒可以引起人的各种传染病，包括普通感冒、水痘、艾滋病和SARS等。研究病毒和宿主细胞的相互作用和在其中的复制以及病毒如何入侵和参与免疫系统，是开发抗病毒治疗方案的核心问题。Athena通过超乎灵敏的流式分析系统基于图像的多种参数可以鉴定病毒感染细胞、衡量感染在凋亡、细胞形变和细胞死亡方面的影响。

示例：AIDS患者和HIV感染者T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义

AIDS患者和HIV感染者的CD4+淋巴细胞降低，CD8+淋巴细胞显著增高，CD4+/CD8+比值倒置。左图为正常组，4区的CD4+40.9%，1区的CD8+26.9%；右图为AIDS组，4区的CD4+0.98%，1区的CD8+50.6%。

  • 微生物学：

微生物因其致病性对于人类健康和疾病预防十分重要。Athena拥有2各物理通道和13个荧光通道，能够对微生物形态变化、菌体增殖、杀菌物质效应和细菌感染对于宿主细胞信号通路和存活等进行数据统计，并结合可视化的组合视图，解决了传统方法中显微镜观察计数等方式，推动了这一领域发展。

示例：用流式细胞仪分析抗生素后效应中细菌的生物学特征。

细菌与抗生素短暂接触后会产生抗生素效应（PAE），菌体大小和核酸含量会发生变化，下图为各抗生素作用大肠埃希氏菌1h，除去药物再培养一段时间的流式检测结果。FSC显示细菌大小的变化，FL2显示细菌核算含量的变化。浅色为正常对照组，深色为实验组。