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流式细胞术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术, 对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点。流式细胞术也已成为生物学、药理学、毒理学、细菌学、病毒学、环境科学和生物工艺监控的有用工具。
在过去的几年中, 流式细胞术已成为研究细菌生长行为的一个重要工具。检测细菌产生胞内产物的能力。如Nile红染色用于检测PHB，PHB是含碳的能源, 并可被生物降解利用的一种热塑性聚合物。流式细胞分选技术一个重要应用是利用荧光标记的靶rRNA寡聚核苷酸探针进行原位杂交来鉴别并分选不同微生物。
技术路线
通过DNA染料可以分析G1期，S期，G2/M期细胞，从而了解植物细胞的生长代谢，并根据研究需要，分选得到纯化的G1期，S期，G2/M期细胞。
植物细胞核DNA含量和倍性水平是植物学研究做的重要基础指标，使用流式细胞技术可以快速准确地分析这些指标，了解种子，花粉精细胞等的倍性情况，由G1期细胞核DNA含量来反映细胞倍性。
生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值是一个很重要的植物学特征，成为植物学家进行种群进化、物种分类和生态学研究的有用分析工具和证据。由于近缘物种的C值极为相似，因而可以通过C值获取基因组大小这一特征信息，用于构建物种的系统进化树，分析亲缘关系，同时可以通过测定C值来鉴定杂交物种。借助植物学细胞C值与气孔保卫细胞长度、面积正相关的规律，通过测量植物化石的气孔长度和面积，可以用已知参考样本物种的C值推断出相应的古植物C值，用于古植物学研究。外来入侵种比同域分布的同属其它种有较小的C值，因此通过检测植物的C值，可以预测入侵能力的强弱，并以此作为生态学评估指标。
一般采用DNA荧光染料PI或DAPI，使用488nm激光器或UV激光器，可以分辨DNA含量相差2.5%的染色体组。2路分选出的单一类型的染色体。流式分选得到的高纯度染色体是构建染色体专性文库和植物基因定位的最好材料。同时利用流式细胞术分检纯化出的染色体在分子生物学后续研究领域有着广阔的应用前景，例如利用PCR技术进行物理图谱的绘制、FISH与PRINS遗传图谱的绘制、植物基因组的分析、染色体蛋白的免疫定位等。
绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 作为一种新型的报告基因具有荧光稳定性好，检测简便，结果真实可靠，不需要任何外源底物或辅助因子的特点。自从20 世纪60年代出现以来，它已引起人们的广泛兴趣，目前已经应用于烟草、柑橘、拟南芥、玉米、水稻、大豆、苜蓿等多种植物材料的研究中。
GFP为植物细胞生物学的发展开创了新的领域。目前，GFP融合蛋白已成功地用于转基因植物研究、基因表达的调控效果研究、基因产物及基因定位研究、植物细胞骨架的动态变化、细胞器的动态和内膜系统的运输、病毒的运动和大分子的运输、完整植株的信号传导研究等研究中。
由于激光技术的发展，目前可供选择的激光器种类越来越多，我们可以根据实验需求（荧光素，染料）选择合适的激光，例如：488nm蓝色激光，640nm红色激光，355nm紫外激光，405nm紫色激光，561nm黄绿激光等。一般情况下，流式细胞仪都会标配488nm激光，用于激发最常用的荧光素或染料如FITC, PE，PI，GFP等。但随着PE系列荧光素的开发应用以及RFP系列荧光转染蛋白的应用，目前561nm的激光器在流式细胞仪特别是流式细胞分选仪应用越来越多，其主要特点有：
荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的
应用. 尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用.
克隆于珊瑚的荧光蛋白具有荧光光谱多样性。既有绿色，也有黄色，且有各类红色。不同野生型的红色荧光蛋白经过一系列体外进化，得到各种不同发射波长的突变体。1999 年报道了第一个红色荧光蛋白 drFP583(DsRed)，其优点显而易见：可与 GFP 系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，因此迅速被关注. 短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标记。
从RFP系列荧光蛋白的激发波长（Ex）来看，561nm是激发红色荧光蛋白的最佳波长激光器，并且与488nm和532nm同时比较灵敏度指数（Sensitivity Index），561nm激光器的灵敏度最高，如下图：
SI=（median fluorescent cells – median non-expressing cells)/(robust SD)
robust SD=(84 percentile non-expressing cells)/(median non-expressing cells).
因此流式细胞分选仪配置561nm激光可以检测RFP转染效果并且分选出高纯度的RFP阳性细胞。
PE和FITC是目前最常用的荧光素种类，通常用488nm蓝色激光激发。用561nm激光器激发PE，可极大提高PE、PE家族染料的检测灵敏度和分辨率，从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物。同时，用561nm激光激发PE，可大大减小PE与FITC的光谱重叠，免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率
使用488nm同时激发FITC和PE，需要进行补偿调节
A：使用488nm同时激发GFP和PE，需要进行补偿调节
B：使用488nm同时激发GFP和PE，基本无需补偿调节
使用488nm激发PE及PE系列荧光素
使用561nm激发PE及PE系列荧光素，灵敏度更高
虽然通常用640nm的红色激光器激发，但使用高功率的561nm激光器（如100mW）也可以很好的检测APC和APC系列荧光素。
肠道微生态系统是人体最大的微生态系统，栖息着大约1014 数量级的细菌，菌种达1000余种，正常成年人的肠道内的微生物总重量有1~2 kg，其细胞总量几乎是人体自身细胞的10倍，其编码的基因数量至少是人体自身基因的100倍[6]。人体的生理代谢是由被称为“肠道元基因组”（肠道菌群的基因组信息的综合）与人体自身的基因组通过与环境相互作用相互影响的。
随着新型DNA测序技术和宏基因组学的发展，越来越多的证据显示肠道微生态的改变可能影响了糖尿病、肥胖、代谢综合征等代谢性疾病的发生发展。已有研究表明，肥胖和代谢综合征个体可发生显著的肠道微生态改变；动物实验结果显示，通过粪便移植可诱导出代谢综合征表型，说明了肠道菌群在代谢综合征中的关键作用。肠道菌群可能通过产生内毒素等免疫毒素诱发慢性炎症，促进胰岛素抵抗和代谢综合征的发生，还可能通过调节能量代谢基因造成脂肪过度积累。由于目前大多数研究是相关性研究，并多源自基因缺陷或无菌小鼠模型等动物实验，来自人体的相应研究显得格外重要。
肠道菌群与代谢疾病之间的分子生物学关系
在人体内, 肠道菌群主要由9 个门的细菌( Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Fusobacteria, Proteobacteria , Verrucomicrobia ,Cyanobacteria , Spirochaeates , VadinBE97) 和一种古菌( Methanobrevibacter smithii) 组成, 其中Firmicutes 和Bacteroidetes 占绝对优势( >98%)。大部分肠道生态系统多样性的信息是在过去十年中随着针对核糖体小亚基核苷酸序列的“非培养”方法的进展才获得的。“独立培养”方法相比最初基于经典的细菌培养方法做出的判断，这些方法的运用揭示出了更为复杂的菌群组成。英光原位杂交法联合流式细胞仪法作为一种无需提取核酸的诱人方法被广泛的用于分析复杂的细菌样本。在该种方法中，探针被荧光染料标记并定位于细胞内的核糖体。每一个杂交细胞将发出荧光并可被流式细胞仪检测并分选出来。
在过去的几年中, 流式细胞术已成为研究细菌生长行为的一个重要工具。检测细菌产生胞内产物的能力。如Nile红染色用于检测PHB，PHB是含碳的能源, 并可被生物降解利用的一种热塑性聚合物。流式细胞分选技术一个重要应用是利用荧光标记的靶rRNA寡聚核苷酸探针进行原位杂交来鉴别并分选不同微生物。
荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或 RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号，来确定 与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布。FISH技术的目标分子通常是16SrRNA，因为它在微生物体内具有较高的拷贝数，分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内 16SrRNA中某段特异性序列设计相应的寡核苷酸探针，就可实现对目标微生物的原位检测。而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列，就可在不同水平 (如属 、种等 )上进行检测。
流式细胞术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术, 对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点。流式细胞术也已成为生物学、药理学、毒理学、细菌学、病毒学、环境科学和生物工艺监控的有用工具。
虽然肠道菌群大小不一，但由于流式细胞技术前向检测（FSC）灵敏度，基本无法通过大小直接将混合样本中的不同菌群直接分选，可通过荧光原位杂交后的荧光信号进行分选。
使用流式细胞技术检测并分选肠道菌群的优势有：
荧光原位杂交+流式分选
细菌细胞内核糖体数量达104～105，核糖体RNA(rRNA)又具有特异区和保守区之分，因此5S rRNA和16S rRNA的指纹图谱和序列常被用作于比较微生物学分类的方法。其中16S rRNA的序列达1500个～12000个核苷酸兼有保守区和可变区之分，因此其序列资料常用于设计基因探针。寡核苷酸对靶核苷酸具有高度特异性，一个碱基发生错配就会显著影响严谨性。基于以上原因源于rRNA的寡核苷酸探针具有高度敏感性和特异性。处于对数生长期的细菌rRNA含量丰富，因此以rRNA为靶基因的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的寡核苷酸探针与靶rRNA杂交后所呈现的荧光可直接通过流失细胞仪检测。
到两群FITC阴性和FITC阳性样本
技术难点
解决策略