使用原位荧光杂交流式细胞分选技术分离肠道特异菌群

研究背景

肠道微生态系统是人体最大的微生态系统,栖息着大约1014 数量级的细菌,菌种达1000余种,正常成年人的肠道内的微生物总重量有1~2 kg,其细胞总量几乎是人体自身细胞的10倍,其编码的基因数量至少是人体自身基因的100倍[6]。人体的生理代谢是由被称为“肠道元基因组”(肠道菌群的基因组信息的综合)与人体自身的基因组通过与环境相互作用相互影响的。

随着新型DNA测序技术和宏基因组学的发展,越来越多的证据显示肠道微生态的改变可能影响了糖尿病、肥胖、代谢综合征等代谢性疾病的发生发展。已有研究表明,肥胖和代谢综合征个体可发生显著的肠道微生态改变;动物实验结果显示,通过粪便移植可诱导出代谢综合征表型,说明了肠道菌群在代谢综合征中的关键作用。肠道菌群可能通过产生内毒素等免疫毒素诱发慢性炎症,促进胰岛素抵抗和代谢综合征的发生,还可能通过调节能量代谢基因造成脂肪过度积累。由于目前大多数研究是相关性研究,并多源自基因缺陷或无菌小鼠模型等动物实验,来自人体的相应研究显得格外重要。

肠道菌群与代谢疾病之间的分子生物学关系

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技术原理

在人体内, 肠道菌群主要由9 个门的细菌( Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Fusobacteria, Proteobacteria , Verrucomicrobia ,Cyanobacteria , Spirochaeates , VadinBE97) 和一种古菌( Methanobrevibacter smithii) 组成, 其中Firmicutes 和Bacteroidetes 占绝对优势( >98%)。大部分肠道生态系统多样性的信息是在过去十年中随着针对核糖体小亚基核苷酸序列的“非培养”方法的进展才获得的。“独立培养”方法相比最初基于经典的细菌培养方法做出的判断,这些方法的运用揭示出了更为复杂的菌群组成。英光原位杂交法联合流式细胞仪法作为一种无需提取核酸的诱人方法被广泛的用于分析复杂的细菌样本。在该种方法中,探针被荧光染料标记并定位于细胞内的核糖体。每一个杂交细胞将发出荧光并可被流式细胞仪检测并分选出来。

在过去的几年中, 流式细胞术已成为研究细菌生长行为的一个重要工具。检测细菌产生胞内产物的能力。如Nile红染色用于检测PHB,PHB是含碳的能源, 并可被生物降解利用的一种热塑性聚合物。流式细胞分选技术一个重要应用是利用荧光标记的靶rRNA寡聚核苷酸探针进行原位杂交来鉴别并分选不同微生物。

荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或 RNA分子杂交,通过在荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号,来确定 与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布。FISH技术的目标分子通常是16SrRNA,因为它在微生物体内具有较高的拷贝数,分布广泛、功能稳定,而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内 16SrRNA中某段特异性序列设计相应的寡核苷酸探针,就可实现对目标微生物的原位检测。而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列,就可在不同水平 (如属 、种等 )上进行检测。

流式细胞术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术, 对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点。流式细胞术也已成为生物学、药理学、毒理学、细菌学、病毒学、环境科学和生物工艺监控的有用工具。

虽然肠道菌群大小不一,但由于流式细胞技术前向检测(FSC)灵敏度,基本无法通过大小直接将混合样本中的不同菌群直接分选,可通过荧光原位杂交后的荧光信号进行分选。

使用流式细胞技术检测并分选肠道菌群的优势有:

  1. 多参数分析(大小,荧光信号)
  2. 高速处理(30000 细胞/秒)
  3. 无需扩增
  4. 准确度高(CV%< 5%)
  5. 单细胞分析分选

研究方案

荧光原位杂交+流式分选

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技术路线

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研究步骤

  1. 荧光原位杂交

细菌细胞内核糖体数量达104~105,核糖体RNA(rRNA)又具有特异区和保守区之分,因此5S rRNA和16S rRNA的指纹图谱和序列常被用作于比较微生物学分类的方法。其中16S rRNA的序列达1500个~12000个核苷酸兼有保守区和可变区之分,因此其序列资料常用于设计基因探针。寡核苷酸对靶核苷酸具有高度特异性,一个碱基发生错配就会显著影响严谨性。基于以上原因源于rRNA的寡核苷酸探针具有高度敏感性和特异性。处于对数生长期的细菌rRNA含量丰富,因此以rRNA为靶基因的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的寡核苷酸探针与靶rRNA杂交后所呈现的荧光可直接通过流失细胞仪检测。

  • 菌株:获得肠道菌群样本
  • 探针:设计并合成探针
  • 培养:选择合适的培养基培养细菌至对数生长期
  • 原位杂交:取重悬菌液与杂交缓冲液孵育杂交
  1. 流式荧光分选
  • PI染色:原位杂交的重悬菌液与PI染料孵育,以区别死活细菌
  • 分析:选择双参数(FITC与FSC/SSC)做散点图,调整电压,分别找

到两群FITC阴性和FITC阳性样本

  • 分选:选择FITC阳性群,设门,设置分选模式
  • 收集样本并进行下游分析。

技术难点

  1. FISH技术最大优势在于它的特异性、快速性和客观性。然而,FISH 技术也有一些缺陷,如探针接近靶区域的能力,寡核苷酸探针的可变性,自发荧光现象(autofluorescence)以及荧光淬灭等。
  1. 由于细菌大小不一,形状各异,有杆状,有球状,分选的纯度和得率都会受到影响。

解决策略

  1. 针对荧光原位杂交种自发荧光现象,可以进行标记荧光素的优化,除了选择常用的FITC荧光素,可以选择一些特异性较好,荧光亮度强的荧光素。
  2. 针对细菌形状,需要在分选过程中控制压力,降低分选速度以获得较好的分选结果。

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