561nm激光应用

由于激光技术的发展,目前可供选择的激光器种类越来越多,我们可以根据实验需求(荧光素,染料)选择合适的激光,例如:488nm蓝色激光,640nm红色激光,355nm紫外激光,405nm紫色激光,561nm黄绿激光等。一般情况下,流式细胞仪都会标配488nm激光,用于激发最常用的荧光素或染料如FITC, PE,PI,GFP等。但随着PE系列荧光素的开发应用以及RFP系列荧光转染蛋白的应用,目前561nm的激光器在流式细胞仪特别是流式细胞分选仪应用越来越多,其主要特点有:

  1. 561nm激光检测RFP系列红色荧光转染蛋白

荧光蛋白作为分子标签,在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的

应用. 尤其是在细胞分子影像的应用方面,可以通过融合蛋白技术,将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上,以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用.

克隆于珊瑚的荧光蛋白具有荧光光谱多样性。既有绿色,也有黄色,且有各类红色。不同野生型的红色荧光蛋白经过一系列体外进化,得到各种不同发射波长的突变体。1999 年报道了第一个红色荧光蛋白 drFP583(DsRed),其优点显而易见:可与 GFP 系列荧光蛋白共用,且激发和发射波长更长,细胞内成像背景低,因此迅速被关注. 短短数年,对红色荧光蛋白的一系列研究,极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性,为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标记。

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8a

从RFP系列荧光蛋白的激发波长(Ex)来看,561nm是激发红色荧光蛋白的最佳波长激光器,并且与488nm和532nm同时比较灵敏度指数(Sensitivity Index),561nm激光器的灵敏度最高,如下图:

SI=(median fluorescent cells – median non-expressing cells)/(robust SD)

robust SD=(84 percentile non-expressing cells)/(median non-expressing cells).

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8b

因此流式细胞分选仪配置561nm激光可以检测RFP转染效果并且分选出高纯度的RFP阳性细胞。

  1. 561nm激光可以更好的激发PE及PE系列染料,大大降低FITC与PE之间的补偿

PE和FITC是目前最常用的荧光素种类,通常用488nm蓝色激光激发。用561nm激光器激发PE,可极大提高PE、PE家族染料的检测灵敏度和分辨率,从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物。同时,用561nm激光激发PE,可大大减小PE与FITC的光谱重叠,免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率

使用488nm同时激发FITC和PE,需要进行补偿调节

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8c

A:使用488nm同时激发GFP和PE,需要进行补偿调节

B:使用488nm同时激发GFP和PE,基本无需补偿调节

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8d

使用488nm激发PE及PE系列荧光素

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8e

使用561nm激发PE及PE系列荧光素,灵敏度更高

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8f

  1. 使用561nm激光也可激发APC系列荧光素

虽然通常用640nm的红色激光器激发,但使用高功率的561nm激光器(如100mW)也可以很好的检测APC和APC系列荧光素。

相关文章

发表评论

电子邮件地址不会被公开。