作者： sinovale

shadowsocks科学上网教程（4）——iphone/ipad配置

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流式细胞分选技术在植物研究中的应用

  1. 植物细胞周期分析和分选

通过DNA染料可以分析G1期，S期，G2/M期细胞，从而了解植物细胞的生长代谢，并根据研究需要，分选得到纯化的G1期，S期，G2/M期细胞。

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  1. 倍性分析

植物细胞核DNA含量和倍性水平是植物学研究做的重要基础指标，使用流式细胞技术可以快速准确地分析这些指标，了解种子，花粉精细胞等的倍性情况，由G1期细胞核DNA含量来反映细胞倍性。

  1. C值研究

生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值是一个很重要的植物学特征，成为植物学家进行种群进化、物种分类和生态学研究的有用分析工具和证据。由于近缘物种的C值极为相似，因而可以通过C值获取基因组大小这一特征信息，用于构建物种的系统进化树，分析亲缘关系，同时可以通过测定C值来鉴定杂交物种。借助植物学细胞C值与气孔保卫细胞长度、面积正相关的规律，通过测量植物化石的气孔长度和面积，可以用已知参考样本物种的C值推断出相应的古植物C值，用于古植物学研究。外来入侵种比同域分布的同属其它种有较小的C值，因此通过检测植物的C值，可以预测入侵能力的强弱，并以此作为生态学评估指标。

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  1. 植物染色体的分析和分选

一般采用DNA荧光染料PI或DAPI，使用488nm激光器或UV激光器，可以分辨DNA含量相差2.5%的染色体组。2路分选出的单一类型的染色体。流式分选得到的高纯度染色体是构建染色体专性文库和植物基因定位的最好材料。同时利用流式细胞术分检纯化出的染色体在分子生物学后续研究领域有着广阔的应用前景，例如利用PCR技术进行物理图谱的绘制、FISH与PRINS遗传图谱的绘制、植物基因组的分析、染色体蛋白的免疫定位等。

  1. 荧光蛋白表达的分析和分选

绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 作为一种新型的报告基因具有荧光稳定性好，检测简便，结果真实可靠，不需要任何外源底物或辅助因子的特点。自从20 世纪60年代出现以来，它已引起人们的广泛兴趣，目前已经应用于烟草、柑橘、拟南芥、玉米、水稻、大豆、苜蓿等多种植物材料的研究中。

GFP为植物细胞生物学的发展开创了新的领域。目前，GFP融合蛋白已成功地用于转基因植物研究、基因表达的调控效果研究、基因产物及基因定位研究、植物细胞骨架的动态变化、细胞器的动态和内膜系统的运输、病毒的运动和大分子的运输、完整植株的信号传导研究等研究中。

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《穷爸爸富爸爸》选摘

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恐惧

  • 没钱的恐惧会刺激我们努力工作，当我们得到报酬时，贪婪或欲望又开始让我们去想所有钱能买到的东西，于是就形成了一种模式。
  • 起床——上班——付帐——再起床——再上班——再付帐。。。。他们的生活就是在无穷尽地为这两种感觉而奔忙，恐惧和贪婪。
  • 他们害怕没有钱，不愿面对没钱的恐惧，对此他们作出了反应，但不是用他们的头脑。
  • 正是因为如此，他们不去分辨真相，不去思考，只是对感受做出反应。他们感到恐惧，于是去工作，希望钱能消除恐惧，但钱不可能消除恐惧。于是，恐惧追逐着他们，他们只好又去工作，希望钱能消除恐惧，但还是无法摆脱恐惧。
  • 恐惧使他们落入了陷阱，挣钱——工作——挣钱，希望有一天能消除恐惧。
  • 但每一天他们起床时，就会发现恐惧又同他们一起醒来了，恐惧使成千上万的人彻夜难眠，忧心忡忡。所以他们又起床去工作了，希望薪水能杀死那该死的恐惧。
  • 钱主宰着他们的生活，他们拒绝去分辨真相，钱控制了他们的情感和灵魂。

欲望

  • 有人把它称之为贪婪，但我宁可用欲望。希望一些东西更好，更漂亮，更有趣或更令人激动，这是相当正常的。
  • 所以，人们总是为了实现欲望而最终变成是为了钱而工作。
  • 富人也是如此。事实上，许多人致富并非出于欲望，而是出于恐惧，他们认为钱能消除那种没有钱，贫困的恐惧。所以他们积累了很多的钱，可是他们发现恐惧感更加强烈了，他们更加害怕失去钱。
  • 那穷人是不是要快活些？我可不这么认为。闭口不谈钱就像依赖钱一样是一种心理疾病。

561nm激光应用

由于激光技术的发展，目前可供选择的激光器种类越来越多，我们可以根据实验需求（荧光素，染料）选择合适的激光，例如：488nm蓝色激光，640nm红色激光，355nm紫外激光，405nm紫色激光，561nm黄绿激光等。一般情况下，流式细胞仪都会标配488nm激光，用于激发最常用的荧光素或染料如FITC, PE，PI，GFP等。但随着PE系列荧光素的开发应用以及RFP系列荧光转染蛋白的应用，目前561nm的激光器在流式细胞仪特别是流式细胞分选仪应用越来越多，其主要特点有：

  1. 561nm激光检测RFP系列红色荧光转染蛋白

荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的

应用. 尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用.

克隆于珊瑚的荧光蛋白具有荧光光谱多样性。既有绿色，也有黄色，且有各类红色。不同野生型的红色荧光蛋白经过一系列体外进化，得到各种不同发射波长的突变体。1999 年报道了第一个红色荧光蛋白 drFP583(DsRed)，其优点显而易见：可与 GFP 系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，因此迅速被关注. 短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标记。

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从RFP系列荧光蛋白的激发波长（Ex）来看，561nm是激发红色荧光蛋白的最佳波长激光器，并且与488nm和532nm同时比较灵敏度指数（Sensitivity Index），561nm激光器的灵敏度最高，如下图：

SI=（median fluorescent cells – median non-expressing cells)/(robust SD)

robust SD=(84 percentile non-expressing cells)/(median non-expressing cells).

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因此流式细胞分选仪配置561nm激光可以检测RFP转染效果并且分选出高纯度的RFP阳性细胞。

  1. 561nm激光可以更好的激发PE及PE系列染料，大大降低FITC与PE之间的补偿

PE和FITC是目前最常用的荧光素种类，通常用488nm蓝色激光激发。用561nm激光器激发PE，可极大提高PE、PE家族染料的检测灵敏度和分辨率，从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物。同时，用561nm激光激发PE，可大大减小PE与FITC的光谱重叠，免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率

使用488nm同时激发FITC和PE，需要进行补偿调节

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A：使用488nm同时激发GFP和PE，需要进行补偿调节

B：使用488nm同时激发GFP和PE，基本无需补偿调节

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使用488nm激发PE及PE系列荧光素

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使用561nm激发PE及PE系列荧光素，灵敏度更高

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  1. 使用561nm激光也可激发APC系列荧光素

虽然通常用640nm的红色激光器激发，但使用高功率的561nm激光器（如100mW）也可以很好的检测APC和APC系列荧光素。