平凡之路

实验原理

    Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

  实验步骤

• 直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
• 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
• 可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

• 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
• 4 ℃ 10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）
• 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃ 放置20-30min。

植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导至电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。

• 4 ℃ 10 000rpm离心10min，去上清。

离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

• 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
• 4 ℃ 10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
• 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

实验注意事项

预防RNase污染，应注意以下几个方面

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

全血单个有核细胞Ficoll分离

实验原理

    　外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。

分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

 实验步骤

A. 血液样本量小于 3 ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 15 ml 离心管，小心加入 3 ml 细胞分离液；

2. 用吸管小心吸取细胞样本加于分离液之液面上，400~550 g，离心 20~30 min；

3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；

第四层为红细胞层；

4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；

5. 250 g，离心 10 min；

6. 弃上清；

7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；

8. 250 g，离心 10 min；

9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

B. 血液样本量 3~6 ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 15 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；

2. 用吸管小心吸取细胞样本加于分离液之液面上，400~550 g，离心 20~30 min；

3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；

第四层为红细胞层；

4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；

5. 250 g，离心 10 min；

6. 弃上清；

7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；

8. 250 g，离心 10 min；

9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

C． 血液样本量为 6~10 ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 50 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；

2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500~950 g，离心 20~30 min；

3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；

4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；

5. 250 g，离心 10 min；

6. 弃上清；

7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；

8. 250 g，离心 10 min；

9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

D． 血液样本量为 10~20 ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 50 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；

2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，650~1100 g，离心 20~30 min；

3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；

第四层为红细胞层；

4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；

5. 250 g，离心 10 min；

6. 弃上清；

7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；

8. 250 g，离心 10 min；

9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

•  注意事项
• 根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果，但最大离心力最好不要超过1000g。
• 为获得最佳的实验结果，最好在取血 2 h 内进行实验。血液存放时间越长，细胞分离效果会越差。血液放置超过 6 h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
• 本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
• 吸取过多的单个核细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出，从而使混杂的粒细胞数量增加。
• 当血液样本粘度过高需稀释时，最优稀释方法：将血液与样本稀释液1:1 稀释混匀后备用。

实验原理

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

操作步骤

• 取枸橼酸钠抗凝外周血2ml加8ml 1×红细胞裂解液放在15ml离心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm离心10min,去除上清。
• 加1×红细胞裂解液4ml,充分混匀, ,3000rpm离心10min,去除上清，加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k摇匀， 37℃摇床过夜(>8h)。
• 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和充分混匀，静置10分钟， 离心3000rpm×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中，加等体积饱和酚，混匀，离心3000rpm×10min，取上层水相到另一管中。
• 加等体积酚/氯仿(1：1)，轻轻混匀，离心3000rpm×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
• 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心3000rpm×10min 。取上层水相到另一管中， 加2倍体积的无水乙醇及少量生理盐水，轻轻倒置混匀。
• 待絮状物出现后，离心12000rpm×10min，弃上清液。
• 沉淀用75%乙醇洗涤，离心12000rpm×10min ，弃上清液。
• 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加TE水溶解过夜。Nanodrop 核酸定量分析仪测定DNA浓度并记录，最后将所提DNA放置-20℃冻存。

• DNA提取的注意事项
• 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
• 酚一定要碱平衡，使用平衡饱和酚。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
• 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
• 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
• 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
• 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
• 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
• 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
• 要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降
• 避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。
• 吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。
• 在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。
• 加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。
• 加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA。
• 将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。
• 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
• 酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。