实验原理
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
操作步骤
- 取枸橼酸钠抗凝外周血2ml加8ml 1×红细胞裂解液放在15ml离心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm离心10min,去除上清。
- 加1×红细胞裂解液4ml,充分混匀, ,3000rpm离心10min,去除上清，加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k摇匀， 37℃摇床过夜(>8h)。
- 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和充分混匀，静置10分钟， 离心3000rpm×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中，加等体积饱和酚，混匀，离心3000rpm×10min，取上层水相到另一管中。
- 加等体积酚/氯仿(1：1)，轻轻混匀，离心3000rpm×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
- 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心3000rpm×10min 。取上层水相到另一管中， 加2倍体积的无水乙醇及少量生理盐水，轻轻倒置混匀。
- 待絮状物出现后，离心12000rpm×10min，弃上清液。
- 沉淀用75%乙醇洗涤，离心12000rpm×10min ，弃上清液。
- 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加TE水溶解过夜。Nanodrop 核酸定量分析仪测定DNA浓度并记录，最后将所提DNA放置-20℃冻存。
- DNA提取的注意事项
- 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
- 酚一定要碱平衡，使用平衡饱和酚。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
- 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
- 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
- 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
- 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
- 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
- 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
- 要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降
- 避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。
- 吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。
- 在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。
- 加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。
- 加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA。
- 将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。
- 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
- 酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。