全血单个有核细胞Ficoll分离
实验原理
外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。
分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
实验步骤
A. 血液样本量小于 3 ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 15 ml 离心管，小心加入 3 ml 细胞分离液；
2. 用吸管小心吸取细胞样本加于分离液之液面上，400~550 g，离心 20~30 min；
3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；
第四层为红细胞层；
4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；
5. 250 g，离心 10 min；
6. 弃上清；
7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；
8. 250 g，离心 10 min；
9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
B. 血液样本量 3~6 ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 15 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；
2. 用吸管小心吸取细胞样本加于分离液之液面上，400~550 g，离心 20~30 min；
3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；
第四层为红细胞层；
4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；
5. 250 g，离心 10 min；
6. 弃上清；
7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；
8. 250 g，离心 10 min；
9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
C． 血液样本量为 6~10 ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 50 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；
2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500~950 g，离心 20~30 min；
3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；
4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；
5. 250 g，离心 10 min；
6. 弃上清；
7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；
8. 250 g，离心 10 min；
9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
D． 血液样本量为 10~20 ml 时，实验方法如下：
1. 取一支 50 ml 离心管，先加入与血液样本量等量的细胞分离液；
2. 用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，650~1100 g，离心 20~30 min；
3. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；
第四层为红细胞层；
4. 用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一 15 ml 离心管中，向所得离心管中加入 10 ml 清洗液，混匀细胞；
5. 250 g，离心 10 min；
6. 弃上清；
7. 用吸管以 5 ml 清洗液重悬所得细胞；
8. 250 g，离心 10 min；
9. 重复 6、7、8，弃上清后以 0.5 ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
- 注意事项
- 根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果，但最大离心力最好不要超过1000g。
- 为获得最佳的实验结果，最好在取血 2 h 内进行实验。血液存放时间越长，细胞分离效果会越差。血液放置超过 6 h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
- 本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
- 吸取过多的单个核细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出，从而使混杂的粒细胞数量增加。
- 当血液样本粘度过高需稀释时，最优稀释方法：将血液与样本稀释液1:1 稀释混匀后备用。