Cell therapy

#Global Cell Therapy R&D Pipelines Development

#China Cell Therapy Companies Layout

1，Approved by NMPA：

• Jun 2021 FosunKite（复星凯特）CD19 200K USD;
• Sep 2021 JW Therapeutics（药明巨诺）CD19 200K USD

2，Aurora/NL Users:

• FosunKite（复星凯特）
• Unicar-therapy（优卡迪）
• ImmunoChina（艺秒神州）
• GracellBio (亘喜）
• Xiangxue Pharmaceutical（香雪制药）
• LegendBiotech（传奇生物）

#Cell Therapy Market Trends

• Car-NK:B-ALL, Breast Cancer, HCC
• TIL :Melanoma, Cervical cancer
• TCR-T: Melanoma, sarcoma
• γδ T
• Crisp- Car-T
• Car- Treg

#Car-NK Potential Advantages

1，Better Safety

No GVHD and low CRS

2，Keep natural anti-tumor cell toxicity

NKp46、NKp44 and NKp30

3，“universal” product potential

From PBMC, UCB, HESC, IPSC

#Car-NK Targets in Hematological and Solid Tumors

#TCR-T for Solid Tumors

#TCR-T develop rapidly in 2021

#TIL Advantages in Solid Tumors

• Good tumor invasion
• Targeted non-selective, tumor-specific killer T cells
• Specific recognition of tumor antigens only
• No genetic engineering, cost saving

#Flow application in cell therapy

• Immune therapy biomarkers screening and evaluation
• Cell therapy products evaluation
• Patients immune function determination
• Monitoring MRD

#Immune therapy biomarkers screening and evaluation

#Cell therapy products evaluation

• Evaluation of transfection efficiency
• Knockout efficiency evaluation
• Tumor killing effectiveness evaluation

#Patients immune function determination

• Immune function database
• TBNK population
• T cell subsets —— dynamic observation

#Guiding Opinions for Clinical Trials of Cellular Immunotherapy Products (Trial)

	Test  Items	Platform
PK	VCN, Virus Vector Copy Number	qPCR/dPCR
Car+ cell number	FCM
PD	Cytokine	ELISA/FCM
Immunogenicity	Drug resistance antibody, ADA/HAMA, Anti-Drug Antibody	ELISA/FCM
CTL, Cytotoxic T- Lymphocyte	FCM
Safety	RCL/RCR Replication Competent Lentivirus	qPCR
Virus integration site detection	NGS
Lentiviral p24 protein detection	ELISA
Car-T cell phenotyping	Lymphocyte subsets, TSCM	FCM

调节性T淋巴细胞流式检测

【实验介绍】调节性T细胞（Treg）是一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%-5%，约占外周血CD4+T细胞的5%-10%。Treg参与免疫应答/免疫耐受调控。CD25表达于大部分的Treg细胞上，CD127是IL-7受体一部分，在Treg上低表达。

【实验方法】取100μL抗凝全血，置于流式管中，向管中加入适量荧光标记的抗体，室温避光孵育20min，再加入2mL 1x溶血素，室温避光孵育10min，1500rpm 离心5min，小心弃去上清，加3mL染色洗液（AMCS）重悬，再1500rpm离心 5min，弃去上清，再加入1mLAMCS重悬进行上机检测。

【主要试剂】CD3-BV605，CD4-FITC，CD8-APC H7，CD25-PE，CD127-APC

【实验结果】

细胞周期流式检测

【实验介绍】使用一些核酸染料和DNA进行结合可对DNA进行定量分析，G0期细胞为不参与增殖周期循环的细胞，即为静止细胞，其细胞为恒定的二倍体DNA含量（2C），G1期细胞参与细胞周期循环，其与G0期细胞DNA含量相同（2C），当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，直至DNA倍增为四倍体细胞，即G2期（4C），最终进入M期，M期为分裂到2个子细胞之前。

【实验原理】正常生物细胞，DNA含量随着细胞增值，周期时相发生变化，即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）、G2/M期（4C）。核酸染料碘化丙啶（PI）能与DNA进行特异性结合，其荧光强度与DNA含量成正比，可以通过流式直方图来进行区分。【主要试剂】PI/RNase染色液

【实验方法】1. 消化：0.25%胰酶（无EDTA）消化，将细胞消化成单细胞；2. 洗涤：2000rpm离心5min，收集细胞，弃上清，加入3mL预冷（4℃）的PBS进行重悬、离心洗涤3次；3. 固定：加入3mL预冷的70%乙醇到细胞沉淀中，于4℃固定过夜；4. 染色：离心收集细胞，加入3mL PBS洗涤两次，加入500μL PBS（含50μg/mL PI，100μg/mL RNase, 0.2%Triton X -100），4℃避光孵育30min；5. 检测：分析前4℃避光保存样本，1h内上样。

【实验结果】

采用FlowJo软件自带的Cell Cycle工具进行分析，其中G1 mean：61979.77，G2 mean：124155.05，G2:G1=2.003。

细胞凋亡流式检测

【实验介绍】细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身程序结束其生命的过程，细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，存在多种抑制或促进凋亡的调控途径，因而可人为的诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。

【实验原理】凋亡细胞形态学发生改变，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，构成早期凋亡的重要生化特征，PS能被特异性的Annexin V-FITC探针所标记，而PI能标记凋亡中期和晚期的细胞，故两者结合可有效区分活细胞、凋亡早期、凋亡晚期和坏死细胞。

【主要试剂】Annexin V-FITC，PI

【实验方法】1. 收集细胞：培养的细胞（酶消化处理）或PBMC， 2000rpm离心5min，PBS洗涤1-2次，制备成单细胞悬液；2. 细胞染色：取细胞约10⁵/管，洗涤后加入染色缓冲液100μL，再加入适量的Annexin-V-AF488和PI 染色液。避光孵育15min，加入染色缓冲液400μL。

【实验结果】Q2-1：活细胞、Q2-4：早期凋亡、Q2-2：晚期凋亡、Q2-1：坏死。

细胞因子流式检测

【实验介绍】细胞因子（CK）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种CK，一种CK也可由多种细胞产生。细胞因子主要分类为：白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、生长因子（G）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、趋化因子等。血液中未活化的白细胞内细胞因子表达极低，当被刺激活化后，胞内细胞因子大量合成并分泌到细胞外发挥作用。

【实验原理】实验采用刺激剂（如佛波酯）来刺激细胞因子分泌，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，再通过细胞固定和打孔等处理后，采用细胞因子特异性的单克隆抗体进行细胞内荧光染色。

【主要试剂】CD3-APC，TNF-α-FITC，INF-γ-PE

【实验方法】1. 对照管和检测管中均加入100μL肝素抗凝全血和100μLPRM1-1640溶液；2. 对照管加入3.4μL 1mg/mL的莫能星工作液，检测管加入5μL 1μg/mL的PMA工作液，4 μI 50 μg/ml Ionomycin 工作液和3.4 μl 1 mg/ml 莫能星工作液。3. 37 ℃，5% CO₂ 培养箱培养 4~6 h。4. 混匀，取出 100 μI，加入适量 CD3-APC，按照试剂盒说明进行孵育；5. 用破膜剂固定和破膜；

6. 加入适量TNF-α-FITC，INF-γ-PE，按照试剂盒说明进行孵育；

7. PBS洗涤，去上清，PBS重悬后上机检测。

【实验结果】

双阳性区域（Q2、Q6）为CD3+T细胞细胞因子分布。

γδT细胞流式检测

【实验介绍】T淋巴细胞亚群根据TCR不同可分为TCR αβT细胞和TCRγδT细胞，γδT细胞可直接识别并结合Ag分子，无需与MHC分子结合，无需APC提呈，血液和淋巴组织中γδT细胞约占总T细胞的1-5%，其执行固有免疫防御（吞噬功能），类APC作用，并分泌IL-2、IFN-γ、IL-17等细胞因子等，与同等数量的αβT细胞相比，其分泌细胞因子的能力更强。

【实验原理】活化的γδT细胞能大量表达IL-2,，结核分枝杆菌低分子多肽抗原（Mtb）能活化PBMC，增值培养后能获得较高比例的γδT细胞，用佛波酯酸（PMA）和离子霉素（IM）活化γδT细胞，检测γδT细胞内的IL-2表达情况，从而表明γδT细胞的百分比。

【主要试剂】CD3-APC、CD8-PE、IL-2-APC-Vio770

【实验方法】1. 细胞制备：分离PBMC细胞，采用RPMI培养基进行活化培养，得到Mtb活化的T细胞（MtbAT）；2. 细胞处理：1mL  PBMC（MtbAT）中依次加入PMA（20ng/ml），IM（1μg/ml），BFA（10μg/ml），37℃、5%CO2条件下培养5h后收集细胞，PBS洗涤并重悬细胞；3. 混匀，取出 100 μI，加入适量 CD3-APC，CD8-PE，按照试剂盒说明进行孵育；4. 固定破膜：用破膜剂固定和破膜；5. 加入适量IL-2-APC-Vio770，混合4 ℃避光孵育30min；

6. 洗涤：PBS洗涤2次并重悬，流式上机检测。

【实验结果】

下图Q1单阴性为TCRγδT细胞。

NK细胞流式检测

【实验介绍】自然杀伤细胞（NK）是一类不依赖抗体且无MHC限制的一类细胞，其识别靶细胞为非特异性，可释放穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等杀伤介质，介导杀伤靶细胞，NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。

【实验原理】NK细胞细胞是一类表达80-90%的CD16和大于95%的CD56具有调节功能的免疫细胞，常联合CD16和CD56作为NK细胞的特异性标志，本实验以外周血作为对象，运用荧光标记的抗体与待侧细胞表面的标志结合，运用流式细胞仪检测特异性荧光信号，最终获得CD3-CD16/56+的NK细胞数量和比例等数据。

【主要染料】CD3-FITC、CD16+56-PE

【主要结果】CD3-CD16+56+为NK细胞群体

间充质干细胞（MSC）流式检测

【实验介绍】间充质干细胞（MSCs）是继胚胎干细胞和造血干细胞之后具有多向分化的实用型干细胞，其具有如下特征：1）强大的增值能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种细胞的能力。2）免疫调节功能：通过细胞间的相互作用及产生细胞因子干扰树突状细胞功能并抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。3）来源多样、取材方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。

【实验原理】hMSCs能表达CD73、CD90、CD105抗原，基本不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR，实验采用荧光素标记的抗细胞表面抗原单克隆抗体（mAb）对细胞进行表染，并采用mIgG1和mIgG2b作为同型对照，流式细胞术检测其荧光强度的变化。

【主要试剂】CD105-PerCp-Cy5.5、CD73-APC、CD90-FITC、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA_DR-PE、mIgG1-PerCP-Cy5.5/APC/FITC、mIgG2b-PE。

【实验方法 】1. 消化：贴壁细胞使用0.25%胰酶消化，离心弃上清，加入适量染色缓冲液，使细胞浓度约5×10⁶/mL；2. 对照：设定阴性管、同型对照管、单染管和多色样本管；3. 染色：分别加入适量的抗体，再分别加入100μL细胞悬液，室温避光孵育30min；4. 洗涤：加入300-500μL FBS洗涤2次并重悬；5. 检测：混匀后上机检测。

【实验结果】

Tube5为空白对照管、Tube1/3为单染管、Tube6/8为同型对照管、Tube7/9为多色样本管。显示，样本几乎不存在非特异性吸附，CD90和CD105阳性较强，其他未列出指标也都符合hMSC检测指标。