流式细胞技术 —— 从药物研发到临床分析

流式细胞仪使用激光照射荧光试剂染色的细胞,并通过测量荧光和散射光分析细胞类型及特性,可以每秒钟检测数千细胞的多个参数并进一步分选感兴趣的细胞。流式细胞技术可以应用在药物研发的各阶段,包括基础研究,筛选,临床前和临床测试。随着不断增加的生物制品研发,流式细胞技术目前已经成为一个不可替代的方法。

在药物研发中,可以使用流式细胞技术来筛选表型或功能改变的细胞,只需很少量的样本就可以进行多色高通量分析。在临床前阶段,通过检测不同细胞群在全血,组织或其他母体内的免疫表型,流式细胞技术通常被用来评估备选药物。同时,受体占用(RO)也经常包含在临床前测试中以评估药物和靶细胞的结合。

在临床测试阶段,流式细胞技术通常可以用来进行安全性,受体占用和药效动力评估,还可以研究毒理反应机制。

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免疫分型

免疫分型就是分析混合细胞群来检测目标细胞群的存在和比例,通过抗体结合检测这些细胞表面表达的标志物来确定细胞群体。这些细胞群的变化,比如药物作用,可以观察到活化,扩增或迁移。T,B和NK细胞的免疫分型已经是临床前研究中用来评估药物潜在免疫毒性的一个常规实验。

稀有细胞群体鉴定

流式细胞仪是检测稀有细胞群体的一个灵敏平台。比如,调节T细胞在全血中只有总淋巴细胞的1-2%,但是这些细胞却有着非常重要的免疫抑制功能。在使用药物中,监测调节T细胞标志物CD25和FoxP3的表达对确定免疫毒性非常重要。

四聚体技术

四聚体技术可以鉴定对特定抗原反应的T细胞。使用荧光标记的链霉亲和素,流式可以有效监测四聚体。

功能实验

基于流式细胞仪的功能实验可以简单也可以复杂。一般来说,这些实验需要通过抗体结合目标功能通路的蛋白或标志物来实现,可以是区分细胞状态或活力的染料,或者是酶-底物反应。

细胞活化

在细胞活化和分化过程中,淋巴细胞很多黏附分子和生长受体的表达会改变。针对免疫活化或者毒剂存在,一些黏附分子会上调或者下调,最常见的有CD25,CD62L和CD69。

细胞内蛋白表达

目前有多种抗体可以研究不同细胞亚群的胞内蛋白表达。当和淋巴细胞表面标志物结合使用,这些实验对确定的细胞群体对药物作用的评估非常有用。淋巴亚群可以进行的实验包括胞内细胞因子表达和不同的细胞信号表达,从一般的磷酸酪氨酸到特定的磷酸化蛋白。目前最常用的研究T细胞功能的磷酸化蛋白主要是MAP激酶磷酸化合STAT蛋白磷酸化。

细胞死亡和损伤

现在有很多荧光探针可以在流式细胞技术中检测细胞损伤或压力。可以选择的标志物包括膜完整性,细胞活力,死亡通路和氧化压力等。

血小板活化

流式细胞技术分析血小板目前广泛应用于血小板生物和功能检测。分离出的血小板或者抗凝全血可以和不同的试剂孵育,来监测血小板活化阶段。

受体占用

因为很多单抗药治疗集合特定细胞表面受体,通过药物来定量特定细胞亚群的受体占用就很有用。典型的方法包括竞争性和非竞争性荧光标记的单抗。

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免疫原性

免疫原性是指一种药物引起的免疫反应能力。与免疫原性反应相关的担忧主要是抗药抗体(ADA)可能会提高或降低药物的清楚,与药物形成具体而产生毒性,与内源性蛋白发生交叉反应等。常规的ADA检测方法主要是ELISA或ECL。然而,当确定这些抗体的中和潜在时,需要更加复杂的生物实验方法,其中一些是使用流式平台。

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