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基于胚胎干细胞或成体干细胞的细胞治疗目前引起了医学界的广泛关注，很多科学家都在寻找合适的细胞治疗方法来治愈疾病，比如糖尿病，肌萎缩性侧索 硬化症（ALS），帕金森氏病，移植物抗宿主病（GVHD）和癌症。

细胞治疗是指专业医疗人员用结构和功能正常的自体或异体细胞作为“药

物”植入患者体内，以修复受损的组织细胞和器官，部分或全部恢复细胞功能，达到治疗目的的一种技术手段。这里所指的自体细胞是自身的成体干细胞，目前应用较理想的是骨髓干细胞，异体干细胞目前主要指捐献的脐血细胞。根据治疗的疾病不同，植入细胞的方法也有所不同。可分为局部注射、静脉输注、动脉输注、介入治疗等方法。

基于细胞的治疗产品在输血和骨髓移植已经使用了很多年，目前FDA批准的细胞治疗产品包括：

• 细胞注入治疗皮肤损伤
• 临床试验的研究性产品，比如基于细胞的疫苗治疗自免疾病或癌症
• 基于细胞的疗法，用于治疗心脑血管，炎症，自身免疫性，神经退行性疾病和癌症。

细胞治疗产品的一般生产流程包括收获，分离，体外扩增（例如活化，扩增或基因修饰）和冷冻保存。在整个流程中，目前细胞治疗的关注重点在于细胞分离，如何通过合适的分离方法保证细胞纯度，活性和得率。

需要根据目的细胞在原始样本中的浓度，分离后纯度要求来选择合适的细胞分离方法。常用的分离方法有三种，根据物理性质分离（比如密度，大小），生物或基因特性（比如药物耐受，细胞粘附），或者细胞表面抗原表达（免疫分型）。

胞治疗中细胞分离流程

流式细胞分选技术应用与细胞治疗

流式细胞技术已经广泛应用于基础和临床前研究来分离特定的阳性细胞，在临床试验中分离治疗用细胞是，流式细胞技术必须遵守一些准则，包括样本污染，管路清洁，仪器设置，使用者保护，试剂质量和产品QC。

需要考虑问题	流式细胞仪具体问题	解决方案
样本污染和管路清洁	液流系统的清洗	去除细菌，病毒，内毒素；更换管路系统
仪器设置	潜在的二次污染可能	将流式细胞仪放置于生物安全柜或洁净室；
使用者防护	使用者暴露于感染物质	气溶胶防护装置
产品认证	没有QC	制定QC检测

 

S3的独特设计更能有效避免分选过程中的潜在污染：

1. 双上样台设计：专有清洗台自动进行样本管路的反冲清洗，极低的交叉污染
2. 紧凑设计：无需外接液流设备，可以将机器放置在生物安全柜中
3. 自动化设置：仪器全自动化智能设置，每日QC报告

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的、具有活力的细胞，其结构包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分。原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广、可行性强等优点，是植物生物工程的基础。对植物原生质体的研究，可追溯到20世纪60年代，英国植物学家Cocking用酶解方法降解细胞壁，获得了番茄根尖原生质体，自此原生质体的研究得到迅速发展。近年来，由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞，易获得纯合性转化子的特点，及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受到重视。研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面。

由于原生质体失去了细胞壁这一屏障，因而使其具有特殊的优点。原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料；同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础。而且，近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调节机制已成为研究的热点。此外，原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料。

流式细胞技术在原生质体分析方面的应用主要测定原生质体大小、细胞壁生物合成、原生质体与微生物的相互作用、原生质体融合产物分选、被膜抗原的表达等。在植物细胞研究中主要应用于分选出活的原生质体，并通过分选出来的原生质体再生出植株，其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。采用流式细胞术，对酸橙(Citrus aurantium L．)叶肉原生质体和甜橙(C sineniscv．Shamouti)胚性愈伤组织原生质体电融合后再生的体细胞杂种进行分析，结果表明，所有的体细胞杂种植株荧光强度是二倍体对照的两倍，这说明两者的原生质体已经融合。通过使用FCM 分析enod40转染的拟南芥属野生植物原生质体，Guzzo等发现导致前向角散射及细胞大小减少的基因有所表达，说明enod40对原生质体具有直接作用。用流式细胞术对荧光强度进行定量检测，还可以用来定位植物激素结合位点的空间分布，Yamazaki等用生物素化脱落酸(bioABA)来定位蚕豆气孔保卫细胞质膜的脱落酸感应位点，将位点用荧光素标记后，在保卫细胞原生质体表面可以观测到荧光微粒斑点，通过成像系统成功定位脱落酸结合位点的空间分布情况。

流式分选Protoplast的基本步骤

1. 对原生质体进行计数，调整原生质体浓度为5×10⁶mL。
2. 使用S3e流式细胞仪进行分选，收集GFP+原生质体。

• 打开prosort软件，点击“start up”和“Run QC”，仪器自动完成开机和校准
• 点击“New Protocol”，创建合适的实验方案
• 选择“density plot”，画一张FSC/SSC散点图，再画一张GFP/PE-Texas Red散点图
• 调节FSC/SSC电压使细胞群体出现在散点图的中央，调节FL1电压，使野生型对照原生质体群体(non-GFP) 出现在散点图的中央，GFP阳性原生质体群体会在GFP荧光通道信号更强的位置出现（在野生型对照样本中没有这个群体）
• 如有必要，调节补偿，使GFP阴性和阳性原生质体群体分得更开。
• 设置门，圈住GFP阳性群体。需要准备一个non-GFP原生质体阴性对照用以确定门的界限。
• 右键点击需要分选的细胞群体，选择“left sort”，根据实验需要以及目的细胞的百分比，设置分选条件和分选模式

3. 对分选后得到的GFP+原生质体进行离心，弃上清。
4. 分选原生质体后续实验，分析原生质体基因组DNA，蛋白或代谢产物表达水平。

流式细胞分选仪是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现分选。流式细胞分选仪主要用于单细胞群体的研究，多数细胞成分如蛋白质、RNA、DNA、膜质等均可用荧光染料标记，因此，流式细胞分选仪可用于对这些成分的分析，还可用于细胞表面和细胞内的蛋白质活动及功能的研究，以及活细胞中荧光复合蛋白的研究。

过去10年，流式细胞分选技术在真核生物学方面，特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献，在微生物学方面的应用则发展较晚。实际上，微生物学，尤其是细菌学当前面临的一些问题，特别是需要进行快速多参数精确测量分选时，流式细胞分选技术很适合解决此类问题。下表是目前流式细胞分选技术在微生物领域的应用：

 

应用方向	分选目标	选择样本
生理研究	活力，活性	细菌，酵母
蛋白工程	配体结合	表面蛋白/多肽
	酶工程	胞内/胞外酶
细胞特性	细胞杂交，克隆	酵母杂交，文库克隆
	启动子捕获	细菌
生产过剩	免疫荧光染色	蛋白
	自发荧光	生物碱
	非特异性染色	FITC/抗生素生产

 

1. 流式细胞分选技术在突变体文库筛选中的应用
   • 1.1流式细胞分选技术在胞质中表达文库筛选中的应用

流细胞分选仪通常每小时分析10⁷个结果,荧光现象可灵敏、真实、广泛地检测和筛选很多酶活力和蛋白质的亲和力。

精心设计荧光标记的底物，使得将胞质中表达的文库与胞外标记的底物分子进行孵育,当标记的底物与文库结合时，标记的底物就被阻滞在胞内，相应的细胞就带上荧光标记,而未结合的荧光底物可自由通过细胞膜,通过多次洗涤过程可被去除。然后用流式细胞分选仪进行筛选和定量分析，经过几轮筛选后与标记底物特异性结合的克隆就得到极大富集。

1.2  流式细胞分选技术在微生物细胞表面展示文库筛选中的应用

正因为流式强大的分选功能，展示在微生物细胞表面的蛋白质，可以通过加入荧光性配基或底物，采用流式细胞仪进行高通量筛选。表面展示是一种新的基因操作技术，使表达的多肽以融合蛋白形式展现在核糖体、病毒或细胞表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。借以研究多肽的性质、相互识别和作用，筛选特定功能的多肽结构，实现蛋白质的固定化和定向进化。噬菌体表面展示技术和酵母表面展示技术是应用最广泛的技术，流式细胞仪在各种展示技术中的高效准确的筛选应用也越来越被关注和使用。

噬菌体展示文库中挑选克隆，一般需要数轮的淘洗和扩增。由于功能性筛选时干扰因素过多，步骤繁琐，筛选的最后经常需要通过测序识别出高亲和力的克隆，但测序只能通过识别克隆中的共同序列确定，但这样方法不是最佳方案，因为它可能会受到各种因素的干扰例如噬菌体生长率，非特异性结合和其他的选择压力而导致偏向选择。使用微球连接噬菌体的特异抗体，去捕获文库中的噬菌体，再用荧光标记抗体与噬菌体表达蛋白特异性结合，筛选结合的噬菌体。不同的荧光强度的微球来标记不同的展示文库。

酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构，可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。荧光标记靶抗原蛋白，通过流式细胞分选技术对靶标特异性抗体进行高通量的富集筛选。

流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优点:能够定量分析酶活性，同时测定多个参数，并且对每个观察到的克隆进行记录。

2. 基于流式细胞分选技术的酶活性筛选方法

基于流式细胞分选技术的超高通量酶活性筛选方法是新出现的一类高通量筛选技术．它利用流式细胞仪高灵敏度、高通量的特点，能以极高的速度( > 10⁸ / 天)对大容量酶基因文库进行筛选。要使用流式细胞分选技术对酶活性进行筛选，首先必须建立酶活性表现型与其编码基因的偶联，即将酶活性转化为可检测的荧光信号，并与酶所在的细胞构建某种物理联系。现有的酶活性筛选体系可大致分为5 种类型：细胞膜荧光吸附、胞内荧光产物富集、荧光蛋白表达活性报告、基于细胞理化性质的荧光探针活性报告、体外区室化。

2. 病毒与细胞相互作用

用流式细胞技术研究病毒与细胞的关系，已经进行了很多工作，揭示了病毒感染过程、病毒蛋白、T抗原与转化的关系，由此对于从特异性细胞蛋白发展为单克隆或多克隆抗体提供可能性。分子生物学研究在病毒结构、复制、转录、转化、病毒分子与细胞蛋白分子间相互作用等方面已积累丰富资料，但尚缺乏对单细胞的分析。采用流式细胞分选技术结合适当的探针（抗体，DNA或RNA探针）能为上述问题提供解决途径。