Cytek DxP Athena 流式应用

调节性T淋巴细胞流式检测

【实验介绍】调节性T细胞(Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞,约占外周血单个核细胞(PBMC)2%-5%,约占外周血CD4+T细胞的5%-10%。Treg参与免疫应答/免疫耐受调控。CD25表达于大部分的Treg细胞上,CD127是IL-7受体一部分,在Treg上低表达。
【实验方法】取100μL抗凝全血,置于流式管中,向管中加入适量荧光标记的抗体,室温避光孵育20min,再加入2mL 1x溶血素,室温避光孵育10min,1500rpm 离心5min,小心弃去上清,加3mL染色洗液(AMCS)重悬,再1500rpm离心 5min,弃去上清,再加入1mLAMCS重悬进行上机检测。
【主要试剂】CD3-BV605,CD4-FITC,CD8-APC H7,CD25-PE,CD127-APC
【实验结果】

细胞周期流式检测

【实验介绍】使用一些核酸染料和DNA进行结合可对DNA进行定量分析,G0期细胞为不参与增殖周期循环的细胞,即为静止细胞,其细胞为恒定的二倍体DNA含量(2C),G1期细胞参与细胞周期循环,其与G0期细胞DNA含量相同(2C),当细胞进入S期后,DNA含量逐渐增加,直至DNA倍增为四倍体细胞,即G2期(4C),最终进入M期,M期为分裂到2个子细胞之前。
【实验原理】正常生物细胞,DNA含量随着细胞增值,周期时相发生变化,即G0/G1期(2C)、S期(2C→4C)、G2/M期(4C)。核酸染料碘化丙啶(PI)能与DNA进行特异性结合,其荧光强度与DNA含量成正比,可以通过流式直方图来进行区分。【主要试剂】PI/RNase染色液
【实验方法】1. 消化:0.25%胰酶(无EDTA)消化,将细胞消化成单细胞;2. 洗涤:2000rpm离心5min,收集细胞,弃上清,加入3mL预冷(4℃)的PBS进行重悬、离心洗涤3次;3. 固定:加入3mL预冷的70%乙醇到细胞沉淀中,于4℃固定过夜;4. 染色:离心收集细胞,加入3mL PBS洗涤两次,加入500μL PBS(含50μg/mL PI,100μg/mL RNase, 0.2%Triton X -100),4℃避光孵育30min;5. 检测:分析前4℃避光保存样本,1h内上样。

【实验结果】

采用FlowJo软件自带的Cell Cycle工具进行分析,其中G1 mean:61979.77,G2 mean:124155.05,G2:G1=2.003。

细胞凋亡流式检测

【实验介绍】细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身程序结束其生命的过程,细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程,存在多种抑制或促进凋亡的调控途径,因而可人为的诱导或抑制某些细胞的凋亡,从而达到防病、治病的目的。
【实验原理】凋亡细胞形态学发生改变,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,构成早期凋亡的重要生化特征,PS能被特异性的Annexin V-FITC探针所标记,而PI能标记凋亡中期和晚期的细胞,故两者结合可有效区分活细胞、凋亡早期、凋亡晚期和坏死细胞。
【主要试剂】Annexin V-FITC,PI
【实验方法】1. 收集细胞:培养的细胞(酶消化处理)或PBMC, 2000rpm离心5min,PBS洗涤1-2次,制备成单细胞悬液;2. 细胞染色:取细胞约105/管,洗涤后加入染色缓冲液100μL,再加入适量的Annexin-V-AF488和PI 染色液。避光孵育15min,加入染色缓冲液400μL。
【实验结果】Q2-1:活细胞、Q2-4:早期凋亡、Q2-2:晚期凋亡、Q2-1:坏死。

细胞因子流式检测

【实验介绍】细胞因子(CK)主要由免疫细胞产生,也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种CK,一种CK也可由多种细胞产生。细胞因子主要分类为:白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、生长因子(G)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子等。血液中未活化的白细胞内细胞因子表达极低,当被刺激活化后,胞内细胞因子大量合成并分泌到细胞外发挥作用。
【实验原理】实验采用刺激剂(如佛波酯)来刺激细胞因子分泌,同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂(如:莫能霉素),使细胞因子合成后累积在细胞内,再通过细胞固定和打孔等处理后,采用细胞因子特异性的单克隆抗体进行细胞内荧光染色。
【主要试剂】CD3-APC,TNF-α-FITC,INF-γ-PE
【实验方法】1. 对照管和检测管中均加入100μL肝素抗凝全血和100μLPRM1-1640溶液;2. 对照管加入3.4μL 1mg/mL的莫能星工作液,检测管加入5μL 1μg/mL的PMA工作液,4 μI 50 μg/ml Ionomycin 工作液和3.4 μl 1 mg/ml 莫能星工作液。3. 37 ℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 h。4. 混匀,取出 100 μI,加入适量 CD3-APC,按照试剂盒说明进行孵育;5. 用破膜剂固定和破膜;

6. 加入适量TNF-α-FITC,INF-γ-PE,按照试剂盒说明进行孵育;

7. PBS洗涤,去上清,PBS重悬后上机检测。

【实验结果】

双阳性区域(Q2、Q6)为CD3+T细胞细胞因子分布。

γδT细胞流式检测

【实验介绍】T淋巴细胞亚群根据TCR不同可分为TCR αβT细胞和TCRγδT细胞,γδT细胞可直接识别并结合Ag分子,无需与MHC分子结合,无需APC提呈,血液和淋巴组织中γδT细胞约占总T细胞的1-5%,其执行固有免疫防御(吞噬功能),类APC作用,并分泌IL-2、IFN-γ、IL-17等细胞因子等,与同等数量的αβT细胞相比,其分泌细胞因子的能力更强。
【实验原理】活化的γδT细胞能大量表达IL-2,,结核分枝杆菌低分子多肽抗原(Mtb)能活化PBMC,增值培养后能获得较高比例的γδT细胞,用佛波酯酸(PMA)和离子霉素(IM)活化γδT细胞,检测γδT细胞内的IL-2表达情况,从而表明γδT细胞的百分比。
【主要试剂】CD3-APC、CD8-PE、IL-2-APC-Vio770
【实验方法】1. 细胞制备:分离PBMC细胞,采用RPMI培养基进行活化培养,得到Mtb活化的T细胞(MtbAT);2. 细胞处理:1mL  PBMC(MtbAT)中依次加入PMA(20ng/ml),IM(1μg/ml),BFA(10μg/ml),37℃、5%CO2条件下培养5h后收集细胞,PBS洗涤并重悬细胞;3. 混匀,取出 100 μI,加入适量 CD3-APC,CD8-PE,按照试剂盒说明进行孵育;4. 固定破膜:用破膜剂固定和破膜;5. 加入适量IL-2-APC-Vio770,混合4 ℃避光孵育30min;

6. 洗涤:PBS洗涤2次并重悬,流式上机检测。

【实验结果】

下图Q1单阴性为TCRγδT细胞。

NK细胞流式检测

【实验介绍】自然杀伤细胞(NK)是一类不依赖抗体且无MHC限制的一类细胞,其识别靶细胞为非特异性,可释放穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等杀伤介质,介导杀伤靶细胞,NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者,NK活性减低;宿主抗移植物反应者,NK活性升高。
【实验原理】NK细胞细胞是一类表达80-90%的CD16和大于95%的CD56具有调节功能的免疫细胞,常联合CD16和CD56作为NK细胞的特异性标志,本实验以外周血作为对象,运用荧光标记的抗体与待侧细胞表面的标志结合,运用流式细胞仪检测特异性荧光信号,最终获得CD3-CD16/56+的NK细胞数量和比例等数据。
【主要染料】CD3-FITC、CD16+56-PE
【主要结果】CD3-CD16+56+为NK细胞群体

间充质干细胞(MSC)流式检测

【实验介绍】间充质干细胞(MSCs)是继胚胎干细胞和造血干细胞之后具有多向分化的实用型干细胞,其具有如下特征:1)强大的增值能力和多向分化潜能,在适宜的体内或体外环境下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种细胞的能力。2)免疫调节功能:通过细胞间的相互作用及产生细胞因子干扰树突状细胞功能并抑制T细胞的增殖及其免疫反应,从而发挥免疫重建的功能。3)来源多样、取材方便,易于分离、培养、扩增和纯化,多次传代扩增后仍具有干细胞特性。
【实验原理】hMSCs能表达CD73、CD90、CD105抗原,基本不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR,实验采用荧光素标记的抗细胞表面抗原单克隆抗体(mAb)对细胞进行表染,并采用mIgG1和mIgG2b作为同型对照,流式细胞术检测其荧光强度的变化。
【主要试剂】CD105-PerCp-Cy5.5、CD73-APC、CD90-FITC、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA_DR-PE、mIgG1-PerCP-Cy5.5/APC/FITC、mIgG2b-PE。
【实验方法 】1. 消化:贴壁细胞使用0.25%胰酶消化,离心弃上清,加入适量染色缓冲液,使细胞浓度约5×106/mL;2. 对照:设定阴性管、同型对照管、单染管和多色样本管;3. 染色:分别加入适量的抗体,再分别加入100μL细胞悬液,室温避光孵育30min;4. 洗涤:加入300-500μL FBS洗涤2次并重悬;5. 检测:混匀后上机检测。

【实验结果】

Tube5为空白对照管、Tube1/3为单染管、Tube6/8为同型对照管、Tube7/9为多色样本管。显示,样本几乎不存在非特异性吸附,CD90和CD105阳性较强,其他未列出指标也都符合hMSC检测指标。

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