流式细胞分选技术在植物研究中的应用

  1. 植物细胞周期分析和分选

通过DNA染料可以分析G1期,S期,G2/M期细胞,从而了解植物细胞的生长代谢,并根据研究需要,分选得到纯化的G1期,S期,G2/M期细胞。

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  1. 倍性分析

植物细胞核DNA含量和倍性水平是植物学研究做的重要基础指标,使用流式细胞技术可以快速准确地分析这些指标,了解种子,花粉精细胞等的倍性情况,由G1期细胞核DNA含量来反映细胞倍性。

  1. C值研究

生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。C值是一个很重要的植物学特征,成为植物学家进行种群进化、物种分类和生态学研究的有用分析工具和证据。由于近缘物种的C值极为相似,因而可以通过C值获取基因组大小这一特征信息,用于构建物种的系统进化树,分析亲缘关系,同时可以通过测定C值来鉴定杂交物种。借助植物学细胞C值与气孔保卫细胞长度、面积正相关的规律,通过测量植物化石的气孔长度和面积,可以用已知参考样本物种的C值推断出相应的古植物C值,用于古植物学研究。外来入侵种比同域分布的同属其它种有较小的C值,因此通过检测植物的C值,可以预测入侵能力的强弱,并以此作为生态学评估指标。

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  1. 植物染色体的分析和分选

一般采用DNA荧光染料PI或DAPI,使用488nm激光器或UV激光器,可以分辨DNA含量相差2.5%的染色体组。2路分选出的单一类型的染色体。流式分选得到的高纯度染色体是构建染色体专性文库和植物基因定位的最好材料。同时利用流式细胞术分检纯化出的染色体在分子生物学后续研究领域有着广阔的应用前景,例如利用PCR技术进行物理图谱的绘制、FISH与PRINS遗传图谱的绘制、植物基因组的分析、染色体蛋白的免疫定位等。

  1. 荧光蛋白表达的分析和分选

绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP) 作为一种新型的报告基因具有荧光稳定性好,检测简便,结果真实可靠,不需要任何外源底物或辅助因子的特点。自从20 世纪60年代出现以来,它已引起人们的广泛兴趣,目前已经应用于烟草、柑橘、拟南芥、玉米、水稻、大豆、苜蓿等多种植物材料的研究中。

GFP为植物细胞生物学的发展开创了新的领域。目前,GFP融合蛋白已成功地用于转基因植物研究、基因表达的调控效果研究、基因产物及基因定位研究、植物细胞骨架的动态变化、细胞器的动态和内膜系统的运输、病毒的运动和大分子的运输、完整植株的信号传导研究等研究中。

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561nm激光应用

由于激光技术的发展,目前可供选择的激光器种类越来越多,我们可以根据实验需求(荧光素,染料)选择合适的激光,例如:488nm蓝色激光,640nm红色激光,355nm紫外激光,405nm紫色激光,561nm黄绿激光等。一般情况下,流式细胞仪都会标配488nm激光,用于激发最常用的荧光素或染料如FITC, PE,PI,GFP等。但随着PE系列荧光素的开发应用以及RFP系列荧光转染蛋白的应用,目前561nm的激光器在流式细胞仪特别是流式细胞分选仪应用越来越多,其主要特点有:

  1. 561nm激光检测RFP系列红色荧光转染蛋白

荧光蛋白作为分子标签,在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的

应用. 尤其是在细胞分子影像的应用方面,可以通过融合蛋白技术,将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上,以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用.

克隆于珊瑚的荧光蛋白具有荧光光谱多样性。既有绿色,也有黄色,且有各类红色。不同野生型的红色荧光蛋白经过一系列体外进化,得到各种不同发射波长的突变体。1999 年报道了第一个红色荧光蛋白 drFP583(DsRed),其优点显而易见:可与 GFP 系列荧光蛋白共用,且激发和发射波长更长,细胞内成像背景低,因此迅速被关注. 短短数年,对红色荧光蛋白的一系列研究,极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性,为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标记。

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从RFP系列荧光蛋白的激发波长(Ex)来看,561nm是激发红色荧光蛋白的最佳波长激光器,并且与488nm和532nm同时比较灵敏度指数(Sensitivity Index),561nm激光器的灵敏度最高,如下图:

SI=(median fluorescent cells – median non-expressing cells)/(robust SD)

robust SD=(84 percentile non-expressing cells)/(median non-expressing cells).

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因此流式细胞分选仪配置561nm激光可以检测RFP转染效果并且分选出高纯度的RFP阳性细胞。

  1. 561nm激光可以更好的激发PE及PE系列染料,大大降低FITC与PE之间的补偿

PE和FITC是目前最常用的荧光素种类,通常用488nm蓝色激光激发。用561nm激光器激发PE,可极大提高PE、PE家族染料的检测灵敏度和分辨率,从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物。同时,用561nm激光激发PE,可大大减小PE与FITC的光谱重叠,免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率

使用488nm同时激发FITC和PE,需要进行补偿调节

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A:使用488nm同时激发GFP和PE,需要进行补偿调节

B:使用488nm同时激发GFP和PE,基本无需补偿调节

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使用488nm激发PE及PE系列荧光素

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使用561nm激发PE及PE系列荧光素,灵敏度更高

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  1. 使用561nm激光也可激发APC系列荧光素

虽然通常用640nm的红色激光器激发,但使用高功率的561nm激光器(如100mW)也可以很好的检测APC和APC系列荧光素。

使用原位荧光杂交流式细胞分选技术分离肠道特异菌群

研究背景

肠道微生态系统是人体最大的微生态系统,栖息着大约1014 数量级的细菌,菌种达1000余种,正常成年人的肠道内的微生物总重量有1~2 kg,其细胞总量几乎是人体自身细胞的10倍,其编码的基因数量至少是人体自身基因的100倍[6]。人体的生理代谢是由被称为“肠道元基因组”(肠道菌群的基因组信息的综合)与人体自身的基因组通过与环境相互作用相互影响的。

随着新型DNA测序技术和宏基因组学的发展,越来越多的证据显示肠道微生态的改变可能影响了糖尿病、肥胖、代谢综合征等代谢性疾病的发生发展。已有研究表明,肥胖和代谢综合征个体可发生显著的肠道微生态改变;动物实验结果显示,通过粪便移植可诱导出代谢综合征表型,说明了肠道菌群在代谢综合征中的关键作用。肠道菌群可能通过产生内毒素等免疫毒素诱发慢性炎症,促进胰岛素抵抗和代谢综合征的发生,还可能通过调节能量代谢基因造成脂肪过度积累。由于目前大多数研究是相关性研究,并多源自基因缺陷或无菌小鼠模型等动物实验,来自人体的相应研究显得格外重要。

肠道菌群与代谢疾病之间的分子生物学关系

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技术原理

在人体内, 肠道菌群主要由9 个门的细菌( Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Fusobacteria, Proteobacteria , Verrucomicrobia ,Cyanobacteria , Spirochaeates , VadinBE97) 和一种古菌( Methanobrevibacter smithii) 组成, 其中Firmicutes 和Bacteroidetes 占绝对优势( >98%)。大部分肠道生态系统多样性的信息是在过去十年中随着针对核糖体小亚基核苷酸序列的“非培养”方法的进展才获得的。“独立培养”方法相比最初基于经典的细菌培养方法做出的判断,这些方法的运用揭示出了更为复杂的菌群组成。英光原位杂交法联合流式细胞仪法作为一种无需提取核酸的诱人方法被广泛的用于分析复杂的细菌样本。在该种方法中,探针被荧光染料标记并定位于细胞内的核糖体。每一个杂交细胞将发出荧光并可被流式细胞仪检测并分选出来。

在过去的几年中, 流式细胞术已成为研究细菌生长行为的一个重要工具。检测细菌产生胞内产物的能力。如Nile红染色用于检测PHB,PHB是含碳的能源, 并可被生物降解利用的一种热塑性聚合物。流式细胞分选技术一个重要应用是利用荧光标记的靶rRNA寡聚核苷酸探针进行原位杂交来鉴别并分选不同微生物。

荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或 RNA分子杂交,通过在荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号,来确定 与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布。FISH技术的目标分子通常是16SrRNA,因为它在微生物体内具有较高的拷贝数,分布广泛、功能稳定,而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内 16SrRNA中某段特异性序列设计相应的寡核苷酸探针,就可实现对目标微生物的原位检测。而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列,就可在不同水平 (如属 、种等 )上进行检测。

流式细胞术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术, 对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点。流式细胞术也已成为生物学、药理学、毒理学、细菌学、病毒学、环境科学和生物工艺监控的有用工具。

虽然肠道菌群大小不一,但由于流式细胞技术前向检测(FSC)灵敏度,基本无法通过大小直接将混合样本中的不同菌群直接分选,可通过荧光原位杂交后的荧光信号进行分选。

使用流式细胞技术检测并分选肠道菌群的优势有:

  1. 多参数分析(大小,荧光信号)
  2. 高速处理(30000 细胞/秒)
  3. 无需扩增
  4. 准确度高(CV%< 5%)
  5. 单细胞分析分选

研究方案

荧光原位杂交+流式分选

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技术路线

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研究步骤

  1. 荧光原位杂交

细菌细胞内核糖体数量达104~105,核糖体RNA(rRNA)又具有特异区和保守区之分,因此5S rRNA和16S rRNA的指纹图谱和序列常被用作于比较微生物学分类的方法。其中16S rRNA的序列达1500个~12000个核苷酸兼有保守区和可变区之分,因此其序列资料常用于设计基因探针。寡核苷酸对靶核苷酸具有高度特异性,一个碱基发生错配就会显著影响严谨性。基于以上原因源于rRNA的寡核苷酸探针具有高度敏感性和特异性。处于对数生长期的细菌rRNA含量丰富,因此以rRNA为靶基因的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的寡核苷酸探针与靶rRNA杂交后所呈现的荧光可直接通过流失细胞仪检测。

  • 菌株:获得肠道菌群样本
  • 探针:设计并合成探针
  • 培养:选择合适的培养基培养细菌至对数生长期
  • 原位杂交:取重悬菌液与杂交缓冲液孵育杂交
  1. 流式荧光分选
  • PI染色:原位杂交的重悬菌液与PI染料孵育,以区别死活细菌
  • 分析:选择双参数(FITC与FSC/SSC)做散点图,调整电压,分别找

到两群FITC阴性和FITC阳性样本

  • 分选:选择FITC阳性群,设门,设置分选模式
  • 收集样本并进行下游分析。

技术难点

  1. FISH技术最大优势在于它的特异性、快速性和客观性。然而,FISH 技术也有一些缺陷,如探针接近靶区域的能力,寡核苷酸探针的可变性,自发荧光现象(autofluorescence)以及荧光淬灭等。
  1. 由于细菌大小不一,形状各异,有杆状,有球状,分选的纯度和得率都会受到影响。

解决策略

  1. 针对荧光原位杂交种自发荧光现象,可以进行标记荧光素的优化,除了选择常用的FITC荧光素,可以选择一些特异性较好,荧光亮度强的荧光素。
  2. 针对细菌形状,需要在分选过程中控制压力,降低分选速度以获得较好的分选结果。

流式细胞分选在细胞治疗中的应用

基于胚胎干细胞或成体干细胞的细胞治疗目前引起了医学界的广泛关注,很多科学家都在寻找合适的细胞治疗方法来治愈疾病,比如糖尿病,肌萎缩性侧索 硬化症(ALS),帕金森氏病,移植物抗宿主病(GVHD)和癌症。

细胞治疗是指专业医疗人员用结构和功能正常的自体或异体细胞作为“药

物”植入患者体内,以修复受损的组织细胞和器官,部分或全部恢复细胞功能,达到治疗目的的一种技术手段。这里所指的自体细胞是自身的成体干细胞,目前应用较理想的是骨髓干细胞,异体干细胞目前主要指捐献的脐血细胞。根据治疗的疾病不同,植入细胞的方法也有所不同。可分为局部注射、静脉输注、动脉输注、介入治疗等方法。

基于细胞的治疗产品在输血和骨髓移植已经使用了很多年,目前FDA批准的细胞治疗产品包括:

  • 细胞注入治疗皮肤损伤
  • 临床试验的研究性产品,比如基于细胞的疫苗治疗自免疾病或癌症
  • 基于细胞的疗法,用于治疗心脑血管,炎症,自身免疫性,神经退行性疾病和癌症。

细胞治疗产品的一般生产流程包括收获,分离,体外扩增(例如活化,扩增或基因修饰)和冷冻保存。在整个流程中,目前细胞治疗的关注重点在于细胞分离,如何通过合适的分离方法保证细胞纯度,活性和得率。

需要根据目的细胞在原始样本中的浓度,分离后纯度要求来选择合适的细胞分离方法。常用的分离方法有三种,根据物理性质分离(比如密度,大小),生物或基因特性(比如药物耐受,细胞粘附),或者细胞表面抗原表达(免疫分型)。

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胞治疗中细胞分离流程

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流式细胞分选技术应用与细胞治疗

流式细胞技术已经广泛应用于基础和临床前研究来分离特定的阳性细胞,在临床试验中分离治疗用细胞是,流式细胞技术必须遵守一些准则,包括样本污染,管路清洁,仪器设置,使用者保护,试剂质量和产品QC。

需要考虑问题 流式细胞仪具体问题 解决方案
样本污染和管路清洁 液流系统的清洗 去除细菌,病毒,内毒素;更换管路系统
仪器设置 潜在的二次污染可能 将流式细胞仪放置于生物安全柜或洁净室;
使用者防护 使用者暴露于感染物质 气溶胶防护装置
产品认证 没有QC 制定QC检测

 

S3的独特设计更能有效避免分选过程中的潜在污染:

  1. 双上样台设计:专有清洗台自动进行样本管路的反冲清洗,极低的交叉污染
  2. 紧凑设计:无需外接液流设备,可以将机器放置在生物安全柜中
  3. 自动化设置:仪器全自动化智能设置,每日QC报告

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流式分选植物原生质体

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的、具有活力的细胞,其结构包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分。原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广、可行性强等优点,是植物生物工程的基础。对植物原生质体的研究,可追溯到20世纪60年代,英国植物学家Cocking用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速发展。近年来,由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞,易获得纯合性转化子的特点,及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视。研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面。

由于原生质体失去了细胞壁这一屏障,因而使其具有特殊的优点。原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础。而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调节机制已成为研究的热点。此外,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料。

流式细胞技术在原生质体分析方面的应用主要测定原生质体大小、细胞壁生物合成、原生质体与微生物的相互作用、原生质体融合产物分选、被膜抗原的表达等。在植物细胞研究中主要应用于分选出活的原生质体,并通过分选出来的原生质体再生出植株,其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。采用流式细胞术,对酸橙(Citrus aurantium L.)叶肉原生质体和甜橙(C sineniscv.Shamouti)胚性愈伤组织原生质体电融合后再生的体细胞杂种进行分析,结果表明,所有的体细胞杂种植株荧光强度是二倍体对照的两倍,这说明两者的原生质体已经融合。通过使用FCM 分析enod40转染的拟南芥属野生植物原生质体,Guzzo等发现导致前向角散射及细胞大小减少的基因有所表达,说明enod40对原生质体具有直接作用。用流式细胞术对荧光强度进行定量检测,还可以用来定位植物激素结合位点的空间分布,Yamazaki等用生物素化脱落酸(bioABA)来定位蚕豆气孔保卫细胞质膜的脱落酸感应位点,将位点用荧光素标记后,在保卫细胞原生质体表面可以观测到荧光微粒斑点,通过成像系统成功定位脱落酸结合位点的空间分布情况。

流式分选Protoplast的基本步骤

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  1. 对原生质体进行计数,调整原生质体浓度为5×106mL。
  2. 使用S3e流式细胞仪进行分选,收集GFP+原生质体。
  • 打开prosort软件,点击“start up”和“Run QC”,仪器自动完成开机和校准
  • 点击“New Protocol”,创建合适的实验方案
  • 选择“density plot”,画一张FSC/SSC散点图,再画一张GFP/PE-Texas Red散点图
  • 调节FSC/SSC电压使细胞群体出现在散点图的中央,调节FL1电压,使野生型对照原生质体群体(non-GFP) 出现在散点图的中央,GFP阳性原生质体群体会在GFP荧光通道信号更强的位置出现(在野生型对照样本中没有这个群体)
  • 如有必要,调节补偿,使GFP阴性和阳性原生质体群体分得更开。
  • 设置门,圈住GFP阳性群体。需要准备一个non-GFP原生质体阴性对照用以确定门的界限。
  • 右键点击需要分选的细胞群体,选择“left sort”,根据实验需要以及目的细胞的百分比,设置分选条件和分选模式
  1. 对分选后得到的GFP+原生质体进行离心,弃上清。
  2. 分选原生质体后续实验,分析原生质体基因组DNA,蛋白或代谢产物表达水平。