流式细胞分选技术在微生物学中的应用

流式细胞分选仪是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现分选。流式细胞分选仪主要用于单细胞群体的研究,多数细胞成分如蛋白质、RNA、DNA、膜质等均可用荧光染料标记,因此,流式细胞分选仪可用于对这些成分的分析,还可用于细胞表面和细胞内的蛋白质活动及功能的研究,以及活细胞中荧光复合蛋白的研究。

过去10年,流式细胞分选技术在真核生物学方面,特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献,在微生物学方面的应用则发展较晚。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要进行快速多参数精确测量分选时,流式细胞分选技术很适合解决此类问题。下表是目前流式细胞分选技术在微生物领域的应用:

 

应用方向 分选目标 选择样本
生理研究 活力,活性 细菌,酵母
蛋白工程 配体结合 表面蛋白/多肽
酶工程 胞内/胞外酶
细胞特性 细胞杂交,克隆 酵母杂交,文库克隆
启动子捕获 细菌
 

生产过剩

免疫荧光染色 蛋白
自发荧光 生物碱
非特异性染色 FITC/抗生素生产

 

  1. 流式细胞分选技术在突变体文库筛选中的应用
    • 1.1流式细胞分选技术在胞质中表达文库筛选中的应用

流细胞分选仪通常每小时分析107个结果,荧光现象可灵敏、真实、广泛地检测和筛选很多酶活力和蛋白质的亲和力。

精心设计荧光标记的底物,使得将胞质中表达的文库与胞外标记的底物分子进行孵育,当标记的底物与文库结合时,标记的底物就被阻滞在胞内,相应的细胞就带上荧光标记,而未结合的荧光底物可自由通过细胞膜,通过多次洗涤过程可被去除。然后用流式细胞分选仪进行筛选和定量分析,经过几轮筛选后与标记底物特异性结合的克隆就得到极大富集。

1.2  流式细胞分选技术在微生物细胞表面展示文库筛选中的应用

正因为流式强大的分选功能,展示在微生物细胞表面的蛋白质,可以通过加入荧光性配基或底物,采用流式细胞仪进行高通量筛选。表面展示是一种新的基因操作技术,使表达的多肽以融合蛋白形式展现在核糖体、病毒或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。借以研究多肽的性质、相互识别和作用,筛选特定功能的多肽结构,实现蛋白质的固定化和定向进化。噬菌体表面展示技术和酵母表面展示技术是应用最广泛的技术,流式细胞仪在各种展示技术中的高效准确的筛选应用也越来越被关注和使用。

噬菌体展示文库中挑选克隆,一般需要数轮的淘洗和扩增。由于功能性筛选时干扰因素过多,步骤繁琐,筛选的最后经常需要通过测序识别出高亲和力的克隆,但测序只能通过识别克隆中的共同序列确定,但这样方法不是最佳方案,因为它可能会受到各种因素的干扰例如噬菌体生长率,非特异性结合和其他的选择压力而导致偏向选择。使用微球连接噬菌体的特异抗体,去捕获文库中的噬菌体,再用荧光标记抗体与噬菌体表达蛋白特异性结合,筛选结合的噬菌体。不同的荧光强度的微球来标记不同的展示文库。

酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,融合蛋白诱导表达后,信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构,可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。荧光标记靶抗原蛋白,通过流式细胞分选技术对靶标特异性抗体进行高通量的富集筛选。

流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优点:能够定量分析酶活性,同时测定多个参数,并且对每个观察到的克隆进行记录。

  1. 基于流式细胞分选技术的酶活性筛选方法

基于流式细胞分选技术的超高通量酶活性筛选方法是新出现的一类高通量筛选技术.它利用流式细胞仪高灵敏度、高通量的特点,能以极高的速度( > 108 / 天)对大容量酶基因文库进行筛选。要使用流式细胞分选技术对酶活性进行筛选,首先必须建立酶活性表现型与其编码基因的偶联,即将酶活性转化为可检测的荧光信号,并与酶所在的细胞构建某种物理联系。现有的酶活性筛选体系可大致分为5 种类型:细胞膜荧光吸附、胞内荧光产物富集、荧光蛋白表达活性报告、基于细胞理化性质的荧光探针活性报告、体外区室化。

  1. 病毒与细胞相互作用

用流式细胞技术研究病毒与细胞的关系,已经进行了很多工作,揭示了病毒感染过程、病毒蛋白、T抗原与转化的关系,由此对于从特异性细胞蛋白发展为单克隆或多克隆抗体提供可能性。分子生物学研究在病毒结构、复制、转录、转化、病毒分子与细胞蛋白分子间相互作用等方面已积累丰富资料,但尚缺乏对单细胞的分析。采用流式细胞分选技术结合适当的探针(抗体,DNA或RNA探针)能为上述问题提供解决途径。

流式细胞技术 —— 从药物研发到临床分析

流式细胞仪使用激光照射荧光试剂染色的细胞,并通过测量荧光和散射光分析细胞类型及特性,可以每秒钟检测数千细胞的多个参数并进一步分选感兴趣的细胞。流式细胞技术可以应用在药物研发的各阶段,包括基础研究,筛选,临床前和临床测试。随着不断增加的生物制品研发,流式细胞技术目前已经成为一个不可替代的方法。

在药物研发中,可以使用流式细胞技术来筛选表型或功能改变的细胞,只需很少量的样本就可以进行多色高通量分析。在临床前阶段,通过检测不同细胞群在全血,组织或其他母体内的免疫表型,流式细胞技术通常被用来评估备选药物。同时,受体占用(RO)也经常包含在临床前测试中以评估药物和靶细胞的结合。

在临床测试阶段,流式细胞技术通常可以用来进行安全性,受体占用和药效动力评估,还可以研究毒理反应机制。

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免疫分型

免疫分型就是分析混合细胞群来检测目标细胞群的存在和比例,通过抗体结合检测这些细胞表面表达的标志物来确定细胞群体。这些细胞群的变化,比如药物作用,可以观察到活化,扩增或迁移。T,B和NK细胞的免疫分型已经是临床前研究中用来评估药物潜在免疫毒性的一个常规实验。

稀有细胞群体鉴定

流式细胞仪是检测稀有细胞群体的一个灵敏平台。比如,调节T细胞在全血中只有总淋巴细胞的1-2%,但是这些细胞却有着非常重要的免疫抑制功能。在使用药物中,监测调节T细胞标志物CD25和FoxP3的表达对确定免疫毒性非常重要。

四聚体技术

四聚体技术可以鉴定对特定抗原反应的T细胞。使用荧光标记的链霉亲和素,流式可以有效监测四聚体。

功能实验

基于流式细胞仪的功能实验可以简单也可以复杂。一般来说,这些实验需要通过抗体结合目标功能通路的蛋白或标志物来实现,可以是区分细胞状态或活力的染料,或者是酶-底物反应。

细胞活化

在细胞活化和分化过程中,淋巴细胞很多黏附分子和生长受体的表达会改变。针对免疫活化或者毒剂存在,一些黏附分子会上调或者下调,最常见的有CD25,CD62L和CD69。

细胞内蛋白表达

目前有多种抗体可以研究不同细胞亚群的胞内蛋白表达。当和淋巴细胞表面标志物结合使用,这些实验对确定的细胞群体对药物作用的评估非常有用。淋巴亚群可以进行的实验包括胞内细胞因子表达和不同的细胞信号表达,从一般的磷酸酪氨酸到特定的磷酸化蛋白。目前最常用的研究T细胞功能的磷酸化蛋白主要是MAP激酶磷酸化合STAT蛋白磷酸化。

细胞死亡和损伤

现在有很多荧光探针可以在流式细胞技术中检测细胞损伤或压力。可以选择的标志物包括膜完整性,细胞活力,死亡通路和氧化压力等。

血小板活化

流式细胞技术分析血小板目前广泛应用于血小板生物和功能检测。分离出的血小板或者抗凝全血可以和不同的试剂孵育,来监测血小板活化阶段。

受体占用

因为很多单抗药治疗集合特定细胞表面受体,通过药物来定量特定细胞亚群的受体占用就很有用。典型的方法包括竞争性和非竞争性荧光标记的单抗。

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免疫原性

免疫原性是指一种药物引起的免疫反应能力。与免疫原性反应相关的担忧主要是抗药抗体(ADA)可能会提高或降低药物的清楚,与药物形成具体而产生毒性,与内源性蛋白发生交叉反应等。常规的ADA检测方法主要是ELISA或ECL。然而,当确定这些抗体的中和潜在时,需要更加复杂的生物实验方法,其中一些是使用流式平台。

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wordpress/vps搬家

最近在2台vultr的vps之间迁移wordpress,比如将VPS-1的数据迁移到VPS-2上

VPS-2上建立和VPS-1一样的环境,比如nginx,php,mysql之类

vps-1数据打包

把/home/wwwroot文件夹压缩成一个名叫wwwroot.tar.gz的压缩包,放在当前目录下

将wwwroot.tar.gz的压缩包放到/home/wwwroot/xxx.com/web目录下(网站根目录)

VPS-2获取压缩包

获取压缩包

转移压缩包到/home目录下并解压

数据库导出导入

用phpmyadmin导出数据库,一般为.sql文件。再用同样方法在VPS-2上获取数据库文件,然后依然用phpmyadmin导入数据库。需要注意的是数据库名不要变更。

DNS解析

将dns解析到VPS-2上

如果有更简便的方法,欢迎留言。

生成和使用ssh key登录vps

生成ssh key

  • 在官方页面http://www.chiark.greenend.org.uk/~sgtatham/putty/download.html,下载putty_gen
  • 点击“Generate”按钮。
  • 为增加安全性,您可以输入一个密钥密码。这将需要使用SSH密钥,并防止有人访问您的密钥文件
  • 一旦密钥被生成,点击“save private key”。请务必保存到安全的地方,丢了就找不到了
  • 将生成的密钥内容复制到/root/.ssh/authorized_keys文件内。这就是你需要进入控制面板使用SSH密钥
  • 找到/etc/ssh/sshd_config ,把RSAAuthentication和PubkeyAuthentication两行前面的#注释去掉。
    C – 重启SSHD服务。

用SSH Key登陆VPS

  • 在官方页面http://www.chiark.greenend.org.uk/~sgtatham/putty/download.html,下载putty
  • session里填写ip地址和ssh端口号,一般都是22
  • Connection–SSH–Auth,右边Private key for authentication里选择先前保存的key文件
  • Open

AMH5.3安装pecl_imagick扩展失败的解决办法

给image_magick-7.0安装pecl_imagick-3.4.1扩展的时候总是出错,错误代码为:

这是由于pkg-config缺失引起的,安装下pkg-config即可解决: