561nm激光应用

由于激光技术的发展,目前可供选择的激光器种类越来越多,我们可以根据实验需求(荧光素,染料)选择合适的激光,例如:488nm蓝色激光,640nm红色激光,355nm紫外激光,405nm紫色激光,561nm黄绿激光等。一般情况下,流式细胞仪都会标配488nm激光,用于激发最常用的荧光素或染料如FITC, PE,PI,GFP等。但随着PE系列荧光素的开发应用以及RFP系列荧光转染蛋白的应用,目前561nm的激光器在流式细胞仪特别是流式细胞分选仪应用越来越多,其主要特点有:

  1. 561nm激光检测RFP系列红色荧光转染蛋白

荧光蛋白作为分子标签,在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的

应用. 尤其是在细胞分子影像的应用方面,可以通过融合蛋白技术,将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上,以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用.

克隆于珊瑚的荧光蛋白具有荧光光谱多样性。既有绿色,也有黄色,且有各类红色。不同野生型的红色荧光蛋白经过一系列体外进化,得到各种不同发射波长的突变体。1999 年报道了第一个红色荧光蛋白 drFP583(DsRed),其优点显而易见:可与 GFP 系列荧光蛋白共用,且激发和发射波长更长,细胞内成像背景低,因此迅速被关注. 短短数年,对红色荧光蛋白的一系列研究,极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性,为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标记。

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8a

从RFP系列荧光蛋白的激发波长(Ex)来看,561nm是激发红色荧光蛋白的最佳波长激光器,并且与488nm和532nm同时比较灵敏度指数(Sensitivity Index),561nm激光器的灵敏度最高,如下图:

SI=(median fluorescent cells – median non-expressing cells)/(robust SD)

robust SD=(84 percentile non-expressing cells)/(median non-expressing cells).

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8b

因此流式细胞分选仪配置561nm激光可以检测RFP转染效果并且分选出高纯度的RFP阳性细胞。

  1. 561nm激光可以更好的激发PE及PE系列染料,大大降低FITC与PE之间的补偿

PE和FITC是目前最常用的荧光素种类,通常用488nm蓝色激光激发。用561nm激光器激发PE,可极大提高PE、PE家族染料的检测灵敏度和分辨率,从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物。同时,用561nm激光激发PE,可大大减小PE与FITC的光谱重叠,免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率

使用488nm同时激发FITC和PE,需要进行补偿调节

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8c

A:使用488nm同时激发GFP和PE,需要进行补偿调节

B:使用488nm同时激发GFP和PE,基本无需补偿调节

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8d

使用488nm激发PE及PE系列荧光素

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8e

使用561nm激发PE及PE系列荧光素,灵敏度更高

561nm%e6%bf%80%e5%85%89%e5%ba%94%e7%94%a8f

  1. 使用561nm激光也可激发APC系列荧光素

虽然通常用640nm的红色激光器激发,但使用高功率的561nm激光器(如100mW)也可以很好的检测APC和APC系列荧光素。

DNS解析:CNAME和A指针的区别

“dns解析”的图片搜索结果

CNAME

(Canonical Name)记录,(alias from one domain name to another)通常称别名指向 。
通俗点讲就是给你的域名起一个别名。比如你的域名是www.abc.com,想和你的另外一个域名www.cba.com进行绑定,应该在cname的host中填入www,在points中填入www.cba.com。这样一来当你访问www.abc.com的时候自动跳转到www.cba.com,而且浏览器上显示的域名仍然是www.abc.com。看了这个你可能会混淆解析和绑定的区别,很多站长认为将一个域名(www.abc.com)cname到另外一个域名(www.cba.com)之后就可以实现:访问www.abc.com得到www.cba.com的内容.
把cName和转向功能混为一谈了。cName只能保证www.abc.com的解析和www.cba.com同步起来,如果是共享ip的主机,不绑定还是访问不到网站内容。这就是为什么如果你设置cname到你的新浪sae域名,如果sae没有将你和他绑定你还是访问不了他的原因。

A

(Address) 记录是用来指定主机名(或域名)对应的IP地址记录 用户可以将该域名下的网站服务器指向到自己的web server上。同时也可以设置自己域名的二级域名。 就是说:通过A记录,大家可以设置自己的不同域名转到不同的IP上去!还是以abc.com为例,如果你有两个二级域名bbs.abc.com和blog.abc.com,但是这两个域名是分别放在两个空间服务器上的,这时候就要使用到A记录来分开设置对应的IP地址。

ios日历垃圾广告的解决办法

“ios日历”的图片搜索结果

ios10更新以来日历垃圾广告横行,如果收到的话最好不要点拒绝,因为这等于是在告诉骗子这个邮箱是可行的。这很可能会带来进一步的信息泄露,最坏情况可能导致appleID被盗。

方法1——关闭ios系统日历

设置–》日历–》账户–》iCloud–》关闭日历

替代系统日历的办法:

可以将QQ邮箱以exchange的方式绑定进ios,并且同步QQ邮箱内的日历设置。当然,除了QQ以外,google和outlook的邮箱也提供日历服务,不过前者需要梯子比较麻烦。

方法2——更换appleID

打开 appleid.apple.com,登入 Apple ID 的账户页面,点击「账户」一栏最右侧的「编辑」,选择「编辑电子邮件地址」后更改 Apple ID 的关联邮箱即可。

使用原位荧光杂交流式细胞分选技术分离肠道特异菌群

研究背景

肠道微生态系统是人体最大的微生态系统,栖息着大约1014 数量级的细菌,菌种达1000余种,正常成年人的肠道内的微生物总重量有1~2 kg,其细胞总量几乎是人体自身细胞的10倍,其编码的基因数量至少是人体自身基因的100倍[6]。人体的生理代谢是由被称为“肠道元基因组”(肠道菌群的基因组信息的综合)与人体自身的基因组通过与环境相互作用相互影响的。

随着新型DNA测序技术和宏基因组学的发展,越来越多的证据显示肠道微生态的改变可能影响了糖尿病、肥胖、代谢综合征等代谢性疾病的发生发展。已有研究表明,肥胖和代谢综合征个体可发生显著的肠道微生态改变;动物实验结果显示,通过粪便移植可诱导出代谢综合征表型,说明了肠道菌群在代谢综合征中的关键作用。肠道菌群可能通过产生内毒素等免疫毒素诱发慢性炎症,促进胰岛素抵抗和代谢综合征的发生,还可能通过调节能量代谢基因造成脂肪过度积累。由于目前大多数研究是相关性研究,并多源自基因缺陷或无菌小鼠模型等动物实验,来自人体的相应研究显得格外重要。

肠道菌群与代谢疾病之间的分子生物学关系

%e4%bd%bf%e7%94%a8%e5%8e%9f%e4%bd%8d%e8%8d%a7%e5%85%89%e6%9d%82%e4%ba%a4%e6%b5%81%e5%bc%8f%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%88%86%e9%80%89%e6%8a%80%e6%9c%af%e5%88%86%e7%a6%bb%e8%82%a0%e9%81%93%e7%89%b9%e5%bc%82

技术原理

在人体内, 肠道菌群主要由9 个门的细菌( Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Fusobacteria, Proteobacteria , Verrucomicrobia ,Cyanobacteria , Spirochaeates , VadinBE97) 和一种古菌( Methanobrevibacter smithii) 组成, 其中Firmicutes 和Bacteroidetes 占绝对优势( >98%)。大部分肠道生态系统多样性的信息是在过去十年中随着针对核糖体小亚基核苷酸序列的“非培养”方法的进展才获得的。“独立培养”方法相比最初基于经典的细菌培养方法做出的判断,这些方法的运用揭示出了更为复杂的菌群组成。英光原位杂交法联合流式细胞仪法作为一种无需提取核酸的诱人方法被广泛的用于分析复杂的细菌样本。在该种方法中,探针被荧光染料标记并定位于细胞内的核糖体。每一个杂交细胞将发出荧光并可被流式细胞仪检测并分选出来。

在过去的几年中, 流式细胞术已成为研究细菌生长行为的一个重要工具。检测细菌产生胞内产物的能力。如Nile红染色用于检测PHB,PHB是含碳的能源, 并可被生物降解利用的一种热塑性聚合物。流式细胞分选技术一个重要应用是利用荧光标记的靶rRNA寡聚核苷酸探针进行原位杂交来鉴别并分选不同微生物。

荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或 RNA分子杂交,通过在荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号,来确定 与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布。FISH技术的目标分子通常是16SrRNA,因为它在微生物体内具有较高的拷贝数,分布广泛、功能稳定,而且在系统发育上具有适当的保守性。根据待测微生物体内 16SrRNA中某段特异性序列设计相应的寡核苷酸探针,就可实现对目标微生物的原位检测。而选取在分子遗传性质上保守性不同的特异序列,就可在不同水平 (如属 、种等 )上进行检测。

流式细胞术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术, 对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。流式细胞分选技术具有测量速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点。流式细胞术也已成为生物学、药理学、毒理学、细菌学、病毒学、环境科学和生物工艺监控的有用工具。

虽然肠道菌群大小不一,但由于流式细胞技术前向检测(FSC)灵敏度,基本无法通过大小直接将混合样本中的不同菌群直接分选,可通过荧光原位杂交后的荧光信号进行分选。

使用流式细胞技术检测并分选肠道菌群的优势有:

  1. 多参数分析(大小,荧光信号)
  2. 高速处理(30000 细胞/秒)
  3. 无需扩增
  4. 准确度高(CV%< 5%)
  5. 单细胞分析分选

研究方案

荧光原位杂交+流式分选

%e4%bd%bf%e7%94%a8%e6%b5%81%e5%bc%8f%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%88%86%e9%80%89%e6%8a%80%e6%9c%af%e5%88%86%e7%a6%bb%e8%82%a0%e9%81%93%e7%89%b9%e5%bc%82%e8%8f%8c%e7%be%a4a

技术路线

%e4%bd%bf%e7%94%a8%e6%b5%81%e5%bc%8f%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%88%86%e9%80%89%e6%8a%80%e6%9c%af%e5%88%86%e7%a6%bb%e8%82%a0%e9%81%93%e7%89%b9%e5%bc%82%e8%8f%8c%e7%be%a4b

研究步骤

  1. 荧光原位杂交

细菌细胞内核糖体数量达104~105,核糖体RNA(rRNA)又具有特异区和保守区之分,因此5S rRNA和16S rRNA的指纹图谱和序列常被用作于比较微生物学分类的方法。其中16S rRNA的序列达1500个~12000个核苷酸兼有保守区和可变区之分,因此其序列资料常用于设计基因探针。寡核苷酸对靶核苷酸具有高度特异性,一个碱基发生错配就会显著影响严谨性。基于以上原因源于rRNA的寡核苷酸探针具有高度敏感性和特异性。处于对数生长期的细菌rRNA含量丰富,因此以rRNA为靶基因的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的寡核苷酸探针与靶rRNA杂交后所呈现的荧光可直接通过流失细胞仪检测。

  • 菌株:获得肠道菌群样本
  • 探针:设计并合成探针
  • 培养:选择合适的培养基培养细菌至对数生长期
  • 原位杂交:取重悬菌液与杂交缓冲液孵育杂交
  1. 流式荧光分选
  • PI染色:原位杂交的重悬菌液与PI染料孵育,以区别死活细菌
  • 分析:选择双参数(FITC与FSC/SSC)做散点图,调整电压,分别找

到两群FITC阴性和FITC阳性样本

  • 分选:选择FITC阳性群,设门,设置分选模式
  • 收集样本并进行下游分析。

技术难点

  1. FISH技术最大优势在于它的特异性、快速性和客观性。然而,FISH 技术也有一些缺陷,如探针接近靶区域的能力,寡核苷酸探针的可变性,自发荧光现象(autofluorescence)以及荧光淬灭等。
  1. 由于细菌大小不一,形状各异,有杆状,有球状,分选的纯度和得率都会受到影响。

解决策略

  1. 针对荧光原位杂交种自发荧光现象,可以进行标记荧光素的优化,除了选择常用的FITC荧光素,可以选择一些特异性较好,荧光亮度强的荧光素。
  2. 针对细菌形状,需要在分选过程中控制压力,降低分选速度以获得较好的分选结果。

房价2011

“房价”的图片搜索结果

本文写于2011年,当时发表在QQ空间。

房价,依然会是2011年人民大众议论的焦点。

说到房价,不得不说的是我国一直以来推行的城市化进程。我国现在的城市化已经接近50%,目标是70%以上。为什么我国政府要大力发展城市化进程?这又不得不说我国一大特色国情–人口基数庞大。正式由于人口众多,我国如果采取其他发达国家的发展模式,能源消耗必然成几何数字增长。比如美国,大家都知道美国的town都是建设的非常好的。美国百姓住在town里头的几乎家家户户都有一部小汽车,上下班都要开1个多小时。美国的电网建设也十分发达,几乎涵盖国内每个角落。这些发达的背后是能耗的支持,美国每年的石油进口率都是60%以上,那还是保守数字。但是这套模式在中国行不通,中国的人口太多,如果每个镇每个村都这样来建设,我国的石油,电力,煤炭的消耗那将是天文数字!有专家估计那可能是现在美国消耗的3倍以上。

所以,基于国情,我国必须大力发展城市化。越来越多的人从农村到城市,政府也给到城市里的公民提供工作机会,使之能够养家糊口。但是注意,仅仅是让那些到城市里来的人饿不死而已,我们是人,人必然是有需求的,解决了温饱问题必然要求更多,比如恋爱结婚生孩子,这都是人一生必经的过程。

按照中国的习俗来说,先成家后立业,一套房子就是安身立命的必须品。这个理念在国外是根本站不住脚的,欧美年轻人结婚大多都是借房子住,结婚当天也就请几个比较要好的朋友过来一起吃饭,那还是朋友们每个人带一个菜过来。但是在中国不同,这个观念经过几千年的根深蒂固,已经在每个中国人心中形成了思维定势,结婚必须有房。这个观念虽然道理上说不过去但是这已经成为一种习俗,很难去改变,即使要改业需要时间,那将是很长一段时间。

中国因为能源的问题必须大力发展城市化,那么多的人口涌向城市又因为中国人理念的问题,必然很多人去抢购房屋,这就解释的通为什么中国的房价每年都在提高,无论政府如何调控都是只看涨不看跌。但是现在的房价已经高到人民怨声载道,政府都看不下的地步,温家宝上台十年,每年都在喊口号调控房价,房价还是硬生生的涨了好几倍。加上个地方政府的土地财政政策,中央政府已经下决心要政治房地产业。但是有用吗?就向我前面所说的,在城市化这个大环境下,房价是不可能跌的(除非遇到0809年那种经济危机),只可能让涨的速度变慢一点。神马房产税,神马信贷调控,都是浮云,没用的。

如果还有人看跌房价,那我会问他看跌的周期是多少?3个月,半年,1年?也许短期内由于过高的涨幅和政府的政策调控,房价会在短期内发展向下回调,但是比例绝对不可能大,这基于供需关系。而从长远来看房价必定还是向高处看齐的。现在上海的房价平均已经到2.3万一平了,我相信大多数人都觉得太高了。5年前,06年的时候你是不是也觉得当时的房价很高,来看看现在和06年相比呢,你是不是后悔为什么当时没下狠心去买个房子?道理是一样的,现在房价是高,但是放到5年后来看,是不是还高呢?你会不会还会想为什么2011的时候不去买房子呢?