流式细胞分选技术在微生物学中的应用

流式细胞分选仪是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现分选。流式细胞分选仪主要用于单细胞群体的研究,多数细胞成分如蛋白质、RNA、DNA、膜质等均可用荧光染料标记,因此,流式细胞分选仪可用于对这些成分的分析,还可用于细胞表面和细胞内的蛋白质活动及功能的研究,以及活细胞中荧光复合蛋白的研究。

过去10年,流式细胞分选技术在真核生物学方面,特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献,在微生物学方面的应用则发展较晚。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要进行快速多参数精确测量分选时,流式细胞分选技术很适合解决此类问题。下表是目前流式细胞分选技术在微生物领域的应用:

 

应用方向 分选目标 选择样本
生理研究 活力,活性 细菌,酵母
蛋白工程 配体结合 表面蛋白/多肽
酶工程 胞内/胞外酶
细胞特性 细胞杂交,克隆 酵母杂交,文库克隆
启动子捕获 细菌
 

生产过剩

免疫荧光染色 蛋白
自发荧光 生物碱
非特异性染色 FITC/抗生素生产

 

  1. 流式细胞分选技术在突变体文库筛选中的应用
    • 1.1流式细胞分选技术在胞质中表达文库筛选中的应用

流细胞分选仪通常每小时分析107个结果,荧光现象可灵敏、真实、广泛地检测和筛选很多酶活力和蛋白质的亲和力。

精心设计荧光标记的底物,使得将胞质中表达的文库与胞外标记的底物分子进行孵育,当标记的底物与文库结合时,标记的底物就被阻滞在胞内,相应的细胞就带上荧光标记,而未结合的荧光底物可自由通过细胞膜,通过多次洗涤过程可被去除。然后用流式细胞分选仪进行筛选和定量分析,经过几轮筛选后与标记底物特异性结合的克隆就得到极大富集。

1.2  流式细胞分选技术在微生物细胞表面展示文库筛选中的应用

正因为流式强大的分选功能,展示在微生物细胞表面的蛋白质,可以通过加入荧光性配基或底物,采用流式细胞仪进行高通量筛选。表面展示是一种新的基因操作技术,使表达的多肽以融合蛋白形式展现在核糖体、病毒或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。借以研究多肽的性质、相互识别和作用,筛选特定功能的多肽结构,实现蛋白质的固定化和定向进化。噬菌体表面展示技术和酵母表面展示技术是应用最广泛的技术,流式细胞仪在各种展示技术中的高效准确的筛选应用也越来越被关注和使用。

噬菌体展示文库中挑选克隆,一般需要数轮的淘洗和扩增。由于功能性筛选时干扰因素过多,步骤繁琐,筛选的最后经常需要通过测序识别出高亲和力的克隆,但测序只能通过识别克隆中的共同序列确定,但这样方法不是最佳方案,因为它可能会受到各种因素的干扰例如噬菌体生长率,非特异性结合和其他的选择压力而导致偏向选择。使用微球连接噬菌体的特异抗体,去捕获文库中的噬菌体,再用荧光标记抗体与噬菌体表达蛋白特异性结合,筛选结合的噬菌体。不同的荧光强度的微球来标记不同的展示文库。

酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统。其基本原理是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,融合蛋白诱导表达后,信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构,可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。荧光标记靶抗原蛋白,通过流式细胞分选技术对靶标特异性抗体进行高通量的富集筛选。

流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优点:能够定量分析酶活性,同时测定多个参数,并且对每个观察到的克隆进行记录。

  1. 基于流式细胞分选技术的酶活性筛选方法

基于流式细胞分选技术的超高通量酶活性筛选方法是新出现的一类高通量筛选技术.它利用流式细胞仪高灵敏度、高通量的特点,能以极高的速度( > 108 / 天)对大容量酶基因文库进行筛选。要使用流式细胞分选技术对酶活性进行筛选,首先必须建立酶活性表现型与其编码基因的偶联,即将酶活性转化为可检测的荧光信号,并与酶所在的细胞构建某种物理联系。现有的酶活性筛选体系可大致分为5 种类型:细胞膜荧光吸附、胞内荧光产物富集、荧光蛋白表达活性报告、基于细胞理化性质的荧光探针活性报告、体外区室化。

  1. 病毒与细胞相互作用

用流式细胞技术研究病毒与细胞的关系,已经进行了很多工作,揭示了病毒感染过程、病毒蛋白、T抗原与转化的关系,由此对于从特异性细胞蛋白发展为单克隆或多克隆抗体提供可能性。分子生物学研究在病毒结构、复制、转录、转化、病毒分子与细胞蛋白分子间相互作用等方面已积累丰富资料,但尚缺乏对单细胞的分析。采用流式细胞分选技术结合适当的探针(抗体,DNA或RNA探针)能为上述问题提供解决途径。

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