流式分选植物原生质体

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的、具有活力的细胞,其结构包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分。原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广、可行性强等优点,是植物生物工程的基础。对植物原生质体的研究,可追溯到20世纪60年代,英国植物学家Cocking用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速发展。近年来,由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞,易获得纯合性转化子的特点,及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视。研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面。

由于原生质体失去了细胞壁这一屏障,因而使其具有特殊的优点。原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础。而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调节机制已成为研究的热点。此外,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料。

流式细胞技术在原生质体分析方面的应用主要测定原生质体大小、细胞壁生物合成、原生质体与微生物的相互作用、原生质体融合产物分选、被膜抗原的表达等。在植物细胞研究中主要应用于分选出活的原生质体,并通过分选出来的原生质体再生出植株,其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。采用流式细胞术,对酸橙(Citrus aurantium L.)叶肉原生质体和甜橙(C sineniscv.Shamouti)胚性愈伤组织原生质体电融合后再生的体细胞杂种进行分析,结果表明,所有的体细胞杂种植株荧光强度是二倍体对照的两倍,这说明两者的原生质体已经融合。通过使用FCM 分析enod40转染的拟南芥属野生植物原生质体,Guzzo等发现导致前向角散射及细胞大小减少的基因有所表达,说明enod40对原生质体具有直接作用。用流式细胞术对荧光强度进行定量检测,还可以用来定位植物激素结合位点的空间分布,Yamazaki等用生物素化脱落酸(bioABA)来定位蚕豆气孔保卫细胞质膜的脱落酸感应位点,将位点用荧光素标记后,在保卫细胞原生质体表面可以观测到荧光微粒斑点,通过成像系统成功定位脱落酸结合位点的空间分布情况。

流式分选Protoplast的基本步骤

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  1. 对原生质体进行计数,调整原生质体浓度为5×106mL。
  2. 使用S3e流式细胞仪进行分选,收集GFP+原生质体。
  • 打开prosort软件,点击“start up”和“Run QC”,仪器自动完成开机和校准
  • 点击“New Protocol”,创建合适的实验方案
  • 选择“density plot”,画一张FSC/SSC散点图,再画一张GFP/PE-Texas Red散点图
  • 调节FSC/SSC电压使细胞群体出现在散点图的中央,调节FL1电压,使野生型对照原生质体群体(non-GFP) 出现在散点图的中央,GFP阳性原生质体群体会在GFP荧光通道信号更强的位置出现(在野生型对照样本中没有这个群体)
  • 如有必要,调节补偿,使GFP阴性和阳性原生质体群体分得更开。
  • 设置门,圈住GFP阳性群体。需要准备一个non-GFP原生质体阴性对照用以确定门的界限。
  • 右键点击需要分选的细胞群体,选择“left sort”,根据实验需要以及目的细胞的百分比,设置分选条件和分选模式
  1. 对分选后得到的GFP+原生质体进行离心,弃上清。
  2. 分选原生质体后续实验,分析原生质体基因组DNA,蛋白或代谢产物表达水平。

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